主动脉夹层（aortic dissection，AD）是一种在主动脉中膜层出现退化，变性、坏死等病变基础上，内膜撕裂、血液经裂口注入主动脉壁，使中膜从外膜剥脱的一种病变。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）是主动脉中膜层的主要成分，其增殖迁移能力的改变在AD形成中发挥着重要作用。Rho激酶（Rhoassociated coiled-coil containing protein kinase，ROCK）是最早发现的Rho下游效应分子，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员之一。ROCK与多种心血管疾病的发生有关，并且在血管平滑肌的收缩功能中扮演者重要角色。ROCK包括ROCK I和ROCK II两种亚型，两者的氨基酸序列具有65%的同源性，其中激酶区的同源性高达90%[1]。在大鼠平滑肌细胞的迁移中，ROCK I起主导作用，而ROCK II的作用不明显；在大鼠平滑肌细胞的增殖中，两者的作用均不明显[2]。近期有研究[3]显示，转化生长因子β1（TGF-β1）可呈浓度依赖性诱导人主动脉平滑肌细胞的增殖和迁移，从而促使AD的发生。本研究通过下调VSMC的ROCK I和ROCK II基因，观察其在TGF-β1刺激下对人主动脉平滑肌细胞迁移和增殖的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
细胞：人主动脉平滑肌细胞（H AVSMCs），购于美国ATCC公司。主要试剂：TGF-β1（美国Peprotech公司）；胎牛血清（杭州天杭生物科技有限公司）；胰酶-EDTA（吉诺生物医药技术有限公司）；DMEM高糖培养基（HyClone）；PBS（吉诺生物医药技术有限公司）；青霉素-链霉素溶液（100×）（吉诺生物医药技术有限公司）；siRNA（广州锐博）；Y-27632（美国Selleck）；Opti-MEM I Reduced serum medium（美国Gibco）；Lipofectamine 2000 Transfection Reagent（美国Invitrogen）；GAPDH（ab37168）、ROCK I（ab45171）以及ROCK II（ab125025）（abcam公司）；HRP-Goat anti Rabbit（074-1506）（KPL）；GNM14170型D-Hanks（吉诺生物医药技术有限公司）；AS1086型结晶紫染液（武汉阿斯本生物技术有限公司）；CCK-8检测试剂盒（C0038）（碧云天生物技术有限公司）。主要仪器：SCO6WE型CO2恒温培养箱（SHEL LAB）；SW-CJ-1FD型洁净工作台（苏净安泰）；IX51型倒置显微镜（OLYMPUS）；L400型离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；3422型Transwell板（Corning）；DR-200Bs型酶标检测仪（Diatek）。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养 在37 ℃、5%CO2条件下用含10%FBS的高塘DMEM培养基培养 HA-VSMCs。培养基按照1:100加入青链霉素混合液（含1 000 U/mL青霉素和10 mg/mL链霉素）。HA-VSMCs培养达85%～90%融合率时用胰酶消化细胞，用细胞计数板计数，稀释至所需浓度，按照需要进行细胞干预及后续实验。
1.2.2 siRNA 转染 ⑴ 转染前1 d，胰酶消化收集细胞，加入不含抗生素的培养基，调整细胞密度为2×105个/mL，以每孔2 mL接种至6孔板。转染时要求细胞汇合度为50%～60%。⑵ 转染液制备（siRNA储存液浓度为20 μM），每孔用量如下：用 190 μL Opti-MEI无血清培养基将 10 μL siRNA稀释，轻轻混匀。使用前轻轻摇匀Lipofectamine 2000，取 20 μL Lipofectamine 2000 在 18 μL 无血清培养基中稀释，室温孵育5 min。将前2步缩稀释的siRNA和Lipofectamine 2000混合（总体积400 μL），轻轻混匀，室温静置20 min。⑶ 将孔板内的培养基更换为不含FBS的DMEM培养基，转染孔加1.6 mL，空白孔加2 mL。⑷ 在需要转染的孔中加入400 μL转染液，轻轻摇匀。⑸ 37 ℃培养，转染4～6 h后，细胞换液为含FBS的DMEM培养基，24 h后倒置显微镜下观察转染效果，记录图片，48 h后可检测蛋白表达。
1.2.3 细胞干预实验分组和药物干预（一） ⑴ 空白对照组：正常细胞在完全培养基中培养24 h；⑵ ROCK I siRNA组：ROCK I siRNA转染成功的细胞在完全培养基中培养24 h；⑶ ROCK II siRNA组：ROCK II siRNA转染成功的细胞在完全培养基中培养24 h；⑷ TGF-β1组：正常细胞在含5 ng/mL TGF-β1的完全培养基中培养24 h；⑸ ROCK I siRNA+TGF-β1组： 转 染 ROCK I siRNA的细胞在含5 ng/mL TGF-β1的完全培养基中培养24 h；⑹ ROCK II siRNA+TGF-β1组：转染ROCK II siRNA的细胞在含5 ng/mL TGF-β1的完全培养基中培养24 h。
1.2.4 Western blot检测 上述细胞培养及干预处理后，PBS洗2～3次，加入适量RIPA裂解液，收集细胞至EP管中，4 ℃，12 000 r/min离心10 min；使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度；根据蛋白分子量配制不同浓度SDS-PAGE，样品蛋白上样量为40 μg/孔，电泳条件为浓缩胶80 V，分离胶120 V，至溴酚蓝到达胶板下沿，300 mA电流60 min将蛋白转至PVDF膜；将转好的膜加入封闭液室温摇床封闭1 h。除去封闭液，加入用封闭液稀释好的ROCK I和ROCK II抗体4 ℃过夜；TBST充分洗涤PVDF膜3次，5 min/次，加入用封闭液稀释好的二抗，室温摇床孵育30 min；再用TBST充分洗涤PVDF膜3次，5 min/次，加入适量ECL底物，X光胶片压片后放入显影液显影、定影液定影；使用AlphaEaseFC软件处理系统分析目标带的灰度值，将目的灰度除以内参的灰度，以比较各组目的蛋白的相对表达量。
1.2.5 细胞干预实验分组和药物干预（二） ⑴ 空白对照组：正常细胞在完全培养基中培养24 h；⑵TGF-β1组：正常细胞在含5 ng/mL TGF-β1的完全培养基中培养24 h；⑶ ROCK I siRNA组：转染Rock I siRNA的细胞在含5 ng/mL TGF-β1的完全培养基中培养24 h；⑷ ROCK II siRNA组：转染ROCK II siRNA的细胞在含5 ng/mL TGF-β1的完全培养基中培养24 h；⑸ Y-27632组：Y-27632是ROCK I选择性抑制剂，正常细胞用10 μM Y-27632预处理1 h，之后换培养液，在含5 ng/mL TGF-β1的完全培养基中培养24 h。
1.2.6 细胞迁移实验（Transwell试验） ⑴ 配制染液：0.5%的结晶紫溶液，用时用PBS溶液1:5稀释成0.01%的结晶紫染液；⑵ 将细胞制成105个/mL悬液，取1 mL细胞悬液于1 500 r/min离心5 min，弃上清；⑶ 加入1 mL无血清培养基，吹打均匀后取200 μL细胞悬液放入Transwell小室中；⑷ 24孔板中加入500 μL含10%FBS的完全培养基，将小室放入板中；⑸ 37℃下于CO2 （含量5%）培养箱中培养48 h；⑹ 染色：将小室取出，用PBS洗去培养基，用棉签将上室中的胶和细胞擦除干净，结晶紫染色10 min，洗去表面的结晶紫，于倒置显微镜下对非细胞接种侧拍照。
1.2.7 细胞增殖试验（CCK-8试验） ⑴ 将对数生长期细胞用胰蛋白酶消化，配制成浓度为1×105个/mL的细胞悬液，按10 000细胞/孔接种于96孔板，每孔加100 μL，置于CO2（5%）培养箱中37℃下培养24 h以贴壁；⑵ 继续培养24 h分别更换为100 μL细胞样品各自对应的含有一定浓度药物的培养基，对照组更换为含溶剂的培养基，每个浓度的样本设5个重复；⑶ 所有孔中加入10 μL CCK-8溶液，培养箱中孵育1～4 h；⑷ 使用酶标仪测定450 nm光吸收值，以溶剂处理的细胞为对照组，不含细胞的培养基为空白组。
1.3 统计学处理
结果用SPSS软件做方差分析，统计数据用均值±标准差（
±s）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 转染效果鉴定及不同处理后ROCK I与ROCK II蛋白表达
对HA-VSMCs进行ROCK I siRNA和 ROCK II siRNA 转染24 h后使用倒置显微镜观察转染结果，镜下可见大量平滑肌细胞转染成功（图1）。转染后48 h，Western blot检测转染后ROCK I和ROCK II蛋白表达水平。与空白对照组比较，ROCK I siRNA组ROCK I蛋白表达减少，TGF-β1组ROCK I蛋白表达增加（均P＜0.05）；与TGF-β1组相比，ROCK I siRNA+TGF-β1组ROCK I蛋白表达减少（P＜0.05），ROCK II siRNA+TGF-β1组对ROCK I蛋白表达无明显影响（P＞0.05）。与空白对照组比较，ROCK I siRNA组ROCK II蛋白表达减少（P＜0.05），而TGF-β1组ROCK II蛋白表达无明显变化（P＞0.05）；与TGF-β1组比较，ROCK I siRNA+TGF-β1组ROCK II蛋白表达无明显变化（P＞0.05），ROCK II siRNA+TGF-β1组ROCK II蛋白表达减少（P＜0.05）（图2）。
图1 荧光转染结果（×100） A：ROCK I siRNA转染；B：ROCK II siRNA转染
Figure 1 Fluorescence transfection results (×100) A: ROCK I siRNA transfection; B:ROCK II siRNA transfection
图2 Western bolt检测ROCK I和ROCK II蛋白的表达
Figure 2 Western blot analysis of ROCK I and ROCK II protein expressions
2.2 ROCK I和ROCK II对TGF-β1诱导的HAVSMCs迁移作用的影响
与空白对照组相比，TGF-β1组HA-VSMCs迁移细胞数增加[（208.3±18.9 ）vs. （23.8±1.5），P＜0.0 5]；与T G F-β 1组相比，R O C K I siRNA+TGF-β1组、Y-27632+TGF-β1组细胞迁移数减少[（61.0±1.8） vs. （208.3±18.9）；（63.3±7.4） vs. （208.3±18.9），均P＜0.05]，而ROCK II siRNA+TGF-β1组对细胞迁移无明显变化（P＞0.05）；与Y-27632+TGF-β1组比较，ROCK I siRNA+TGF-β1组细胞迁移数无统计学差异[（61.0±1.8） vs. (63.3±7.4)，P＞0.05]，而ROCK II siRNA+TGF-β1组细胞迁移数增加[（274.5±10.0 ）vs.( 63.3±7.4)，P＜0.05]。对迁移后Transwell小室进行结晶紫染色，倒置显微镜下观察，TGF-β1组和ROCK II siRNA+TGF-β1组平滑肌细胞数量较多；C o n t r o l组、R O C K I siRNA+TGF-β1组和Y-27632+TGF-β1组平滑肌细胞数量较少（图3）。
图3 细胞迁移实验 A：结晶紫染色法观察（×100）；B：各组迁移细胞数比较Figure 3 Cell migration assay A: Crystal violet staining observation (×100); B: Comparison of the numbers of migrating cells among groups
2.3 ROCK I和ROCK II对TGF-β1诱导的HAVSMCs增殖的影响
与空白对照组相比，TGF-β1组OD值升高[（1.350±0.057） vs. (252±0.061)，P＜0.05]；与TGF-β1组比较，ROCK I siRNA+TGF-β1组、ROCK II siRNA+TGF-β1组、Y-27632+TGF-β1组OD值均无统计学差异（均P＞0.05）（图4）。
图4 各组对HA-VSMCs增殖情况比较
Figure 4 Comparison of proliferations of among each group of HA-VSMCs
3 讨 论
近年来，随着生活水平的提高，AD的发生率呈逐年增加的趋势。目前，有关主动脉夹层的回顾性研究分析证实，胸主动脉腔内修复术（thoracic endovascular aortic repair，TEVAR）是治疗AD的首选治疗方案[4-9]。AD常表现为突然地剧烈撕裂样或剥脱样疼痛，其起病急、进展快且病死率高[10]。因此，有关AD的相关基础研究也成为了目前热点课题。
目前研究表明，AD的起始病变位于主动脉中膜层VSMC。在病理刺激下，VSMC的异常增殖与迁移可导致血管结构重构等一系列病理变化。Rho蛋白家族是一类小GTP结合蛋白，目前研究最多是Rho、Rac和Cdc42 3个亚家族，可通过下游效应分子的活性参与细胞骨架动力学。ROCK是首个被发现的小G蛋白下游效应分子，与Rho蛋白一起调节细胞肌动蛋白，与细胞的增殖迁移等多种生物功能密切相关[11]。ROCK在缺氧环境下促进VSMC的增殖与迁移，且可通过促进MMP-2表达从而促使VSMC增殖[12-13]。ROCK包括ROCK I和ROCK II两种亚型。有研究通过siRNA转染下调ROCK I和ROCK II基因表达证实，ROCK I在大鼠平滑肌细胞的迁移中起主导作用，而ROCK II的作用不明显；在大鼠平滑肌细胞的增殖中，两者的作用均不明显。同时又有人通过过表达ROCK I基因证实，ROCK I在大鼠主动脉血管平滑肌细胞的迁移中起主导作用[14]；通过自行设计的针对ROCK II的siRNA转染血管平滑肌细胞使其ROCK II基因下调后观察细胞迁移数量并未受到影响[15]。在AD患者病变组织的中膜层中发现TGF-β1表达明显增强，同时有研究[16-18]显示TGF-β1可呈浓度依赖性诱导HA-VSMCs发生增殖与迁移，而VSMC是主动脉中膜的主要成分。因此，TGF-β1在体内的表达增加诱导HA-VSMCs的增殖与迁移可能是促使主动脉夹层形成的一个重要因素。
为探讨R OCK I和ROC K I I对TGF-β1诱导的HA-VSMCs迁移增殖的影响。本研究利用siRNA技术，使HA-VSMCs的ROCK I和ROCK II基因表达下调，并分别对比加入TGF-β1组和未加入TGF-β1组的ROCK I和ROCK II蛋白表达，结果发现TGF-β1对转染后的蛋白表达有显著影响。又通过Transwell试验和CCK-8试验检测ROCK两种亚型对TGF-β1诱导的HA-VSMCs迁移和增殖的影响。结果显示，与TGF-β1组相比，ROCK I siRNA+TGF-β1组和Y-27632+TGF-β1组对H A-V S M C s迁移起抑制作用，R O C K I I siRNA+TGF-β1组则无明显作用。与TGF-β1组相比，ROCK I siRNA、ROCK II siRNA、Y-27632对HA-VSMCs增殖均没有明显影响。由此可见，ROCK I在TGF-β1诱导的HA-VSMCs迁移中起重要作用，而ROCK II的作用不明显；ROCK I和ROCK II对TGF-β1诱导的HA-VSMCs增殖的影响无统计学差异。
在AD患者中膜层平滑肌细胞的迁移、增殖能力明显增强，发生了由收缩型向合成型的表型转化[19]。有研究[20]显示，TGF-β1可诱导HA-VSMCs发生表型转化，其收缩型的标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白（smooth muscle α-actin，α-SMA）、平滑肌22α（smooth muscle 22α，SM22α）减少，合成型的标志蛋白骨桥蛋白（osteopontin，OPN）增加。因此，下一步将进一步探讨ROCK I和ROCK II对TGF-β1诱导的HA-VSMCs表型转化的影响，对主动脉夹层的机制进行进一步的探索。
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