胰腺癌是种高度恶性的肿瘤，在肿瘤致死疾病中高居第4位[1]。近年来，胰腺癌的发病率呈不断上升趋势，多数患者在诊断时已处于晚期，预后较差。据统计，我国胰腺癌患者5年生存率仅1%～3%[2]。因此，对胰腺癌发生分子机制的探索，将为寻求新的诊断和预后标志物、开发新的治疗策略提供新的思路和依据。microRNA（miRNA）是一类内源性的长约22个核苷酸的高度保守性非编码RNA分子[2]。在调控基因表达方面具有重要作用，往往通过碱基配对绑定到靶基因3'UTR非翻译区，导致靶基因降解或翻译抑制[3]。miRNA能调控约60%的蛋白编码基因[4]，广泛参与细胞分化、生长、发育等多种生物学过程[5]。miRNA在多种人类疾病中呈异常表达，尤其是肿瘤，其异常表达与肿瘤发生发展紧密相关[6]。研究[7]表明，miR-567失调促进乳腺癌的发生，影响肿瘤细胞增殖和迁移。但是miR-567在胰腺癌中的生物学作用尚不清楚。
本研究旨在对miR-567在胰腺癌细胞系中的表达水平进行鉴定，同时采用慢病毒转染诱导过表达分析miR-567对胰腺癌细胞增殖、凋亡及迁移能力的影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料
正常胰腺导管上皮细胞系HPDE6-C7及胰腺癌细胞系Panc-1、AsPC-1、HPAC、BxPC-3均购自北京协和医学院细胞库，Cell Counting Kit-8购自碧云天生物科技有限公司，Annexin V/PI凋亡检测试剂盒购自天津三箭生物技术有限公司，胎牛血清及RPMI-1640培养基均购自美国Roswell公司，TRIzol购自美国Invitrogen公司，TaqMan Real-Time PCR Master Mixes购自美国Thermo Fisher Scientific公司，2×SYBR Green qPCR试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，All-in-One microRNA试剂盒购自美国BD公司，实验所需的KPNA4、Caspase 3、Bax及GAPDH一抗均购自美国BD公司，二抗均购自武汉博士德生物科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 慢病毒包装与纯化 miR-567慢病毒载体构建，以人的基因组为模板，用下述引物扩增前体 hsa-mir-567 MI0003573。miR-567_F（Xho I）：5'-CCG CTC GAG GGA TTC TTA TAG GAC AGT AT-3'；miR-567_R：5（BamHI）'- AGC GGA TCC AGC AAT AAC TTT TTT TTT TTT TAG T-3'，得到前体hsa-mir-567片段后，以Xho I/BamHI克隆到pGMLV-PE1 miR过表达慢病毒载体，测序正确后即得到hsa-miR-567的慢病毒过表达载体。然后进行慢病毒包装和感染细胞。空载体慢病毒感染组为NC组。慢病毒包装使用第二代体系，12 µg pGMLV-PE1 hsa-miR-567 与 CON 载 体、9 µg pSPAX2、3 µg PMD2G 载体转入 293t细胞后，收集48 h上清，即得到病毒上清，病毒上清使用PEG纯化，将病毒上清与PEG体积比4:1混合后，4度沉淀过夜，3 000r/min离心 30min，去上清，沉淀使用无血清1640培养基重悬。
1.2.2 细胞培养、转染及分组 将正常胰腺导管上皮细胞系HPDE6-C7及胰腺癌细胞系Panc-1、AsPC-1、HPAC、BxPC-3种植于 RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清），于37℃、5% CO2培养箱中培养。并将Panc-1细胞系分成3组，miR-567转染组、空载体转染组及空白对照组，分别用含pGMLV-PE1 miR过表达慢病毒载体的慢病毒、空载体慢病毒感染miR-567转染组及空载体转染组细胞，作为空白对照，空白对照组不转染，加PBS做对照。病毒感染复数为10 MOI（病毒:细胞=10:1），培养48 h后行后续实验。
1.2.3 RNA提 取 及 qRT-PCR ⑴ miR-567相对表达量检测：用All-in-One microRNA抽提试剂盒和All-in-One miRNA qRT-PCR 检测试盒提取和分离正常胰腺导管上皮细胞系HPDE6-C7及胰腺癌细胞系miRNA后，使用TaqMan Real-Time PCR Master Mixes 检 测 Panc-1、AsPC-1、HPAC、BxPC-3中miRNA-567的 表 达， 检 测系 统 为 ABI 7500 fast，miRNA QPCR 引 物 购 自Exiqon 公 司（Euroclone，Italy）（Accession No.MI0003573），以U6小核RNA作为内参，使用2−ΔΔCt方法定量，量化miR-567相对表达量。⑵ KPNA4 mRNA检测：使用Trizol提取细胞总RNA后，使用qRT-PCR检测miR-567转染组及空载体转染组细胞中KPNA4 mRNA的相对表达水平，KPNA4 正向引物：5'-CAG GAG ATT CTT CCA GCC CTT TGT GT-3'； 反 向 引 物：5'-ATT ACC ATC TGT ATT TGT TCA TTG CCA GCA TC-3'，GAPDH 正 向 序 列：5'-TAT GCT CTC CTC ATG CAT TG-3'； 反 向 序 列 5'-GGG ACG ACC TTC GAT CTA CC-3'， 按 TAKARA SYBR Premix Ex Taq反应体系进行PCR扩增反应。以GAPDH基因为内参，采用 2−ΔΔCt法计算 KPNA4 mRNA 的相对表达量，实验重复3次，取平均值。
1.2.4 细胞增殖检测 采用CCK-8法，将miR-567转染组、空载体转染组及空白对照组3组细胞消化成单细胞悬液后，按每孔2×103个细胞接种于96孔板上，培养基体积为200 µL。培养24 h后加入 5 mg/mL CCK-8 溶液 40 µL，孵育 4h 后每孔加入200 µL DMSO，摇床上充分震荡。在转染1、2、3、4 d后于450 nm波长测定吸光度值。重复3次，取平均值，作细胞增殖曲线。
1.2.5 细胞凋亡检测 采用Annexin V/PI染色检测，将miR-567转染组、空载体转染组及空白对照组3组细胞消化成单细胞悬液后，PBS清洗2次，并使用Binding Buffer重悬，加入相应比例的Annexin V抗体，避光染色10min后加入适量PBS溶液以及PI染料，流式细胞仪检测Annexin V阳性细胞比例来确定细胞凋亡的变化。
1.2.6 细胞划痕实验 将miR-567转染组、空载体转染组两组细胞接种于6孔板，培养24 h，胰蛋白酶消化细胞，待细胞长至融合后，用200 µL Tips枪头沿培养孔划直线，计算划痕后0、48 h划痕面积，并计算划痕愈合率，实验在标准状态下重复3次，取均值。划痕愈合率=（划痕后即刻的划痕面积-划痕后48 h的划痕面积）/划痕后即刻的划痕面积×100%。迁移能力越强，划痕愈合率越高。
1.2.7 Western blot 将miR-567转染组、空载体转染组两组细胞使用RIPA细胞裂解液冰上裂解30min后，加入相应比例蛋白上样缓冲液，煮沸10min，按 30 µg 的量上样，加入 Western blot预制胶，50 V恒压待样本溴酚蓝跑至浓缩胶与分离胶分界线时，切换至120 V恒压，溴酚蓝跑至胶板底部时，400 mA恒流将蛋白样本转至PVDF膜上， 加 KPNA4（1:200）、caspase-3（1:200）、Bax（1:200）及 GAPDH（1:200）一抗，37℃孵育4 h，二抗（1:500）孵育过夜，ECL液显影，Quantity One 1-D分析软件对蛋白质印迹条带进行定量。目的蛋白相对表达量=目的蛋白测定值/GAPDH，实验重复3次，取平均值。
1.3 统计学处理
数据处理用SPSS 17.0统计软件和Graph软件，计量资料以均数±标准差（
±s）表示，比较采用t检验或方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 miR-567在胰腺癌细胞系中低表达
设miR-567在正常胰腺导管上皮细胞系HPDE6-C7中相对表达量为1.0，在胰腺癌细胞系Panc-1、AsPC-1、HPAC、BxPC-3的相对表达量分别为0.27±0.06、0.34±0.041、0.44±0.033、0.53±0.08，miR-567在胰腺癌细胞系中的表达均明显低于正常胰腺导管上皮细胞系HPDE6-C7（均P＜0.05）（图1）。
图1 miR-567在胰腺癌细胞及正常胰腺导管上皮细胞中的表达 注：1）与HPDE6-C7比较，P＜0.05
Figure 1 miR-567 in pancreatic carcinoma and normal pancreatic cell line Note: 1) P＜0.05 vs. HPDE6-C7
2.2 miR-567过表达抑制Panc-1细胞增殖并促进凋亡
图2 miR-567慢病毒转染对Panc-1细胞miR-567表达及、增殖、凋亡的影响 A：miR-567相对表达量；B：细胞增殖曲线；C：细胞凋亡检测
Figure 2 In fl uence of miR-567 lentivirus vector transfection on miR-567 expression, proliferation and apoptosis in Panc-1 cells A: Relative expression level of miR-567; B: Cell growth curves; C: Cell apoptosis analysis
qRT-PCR检测显示，miR-567转染组miR-567的相对表达量为14.53±0.81，明显高于空白对照组（P＜0.001），空载体转染组与空白对照组miR-567相对表达量差异无统计学意义（P＞0.05）（图2A）。CCK8实验结果显示，miR-567转染组在铺板48 h之后的时间点，OD450值明显小于空白对照组（均P＜0.05），空载体转染组与空白对照组各时间点OD450值差异均无统计学意义（均P＞0.05）（图2B）。流式细胞凋亡检测结果显示，miR-567转染组凋亡率为26.7%，空白对照组为7.1%，空载体转染组为5.7%，miR-567转染组凋亡率显著高于空载体转染组（P＜0.001），空白对照组和空载体转染组凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）（图2C）。
2.3 miR-567过表达抑制Panc-1细胞迁移
细胞划痕实验结果显示，miR-567转染组划痕愈合率为（42.7±2.9）%，空载体转染组为（73.50±5.3）%，差异有统计学意义（P＜0.01）（图3）。
2.4 miR-567过表达对KPNA4及凋亡相关蛋白表达的影响
以空载体转染组为对照，设其各指标的表达量为1，qRT-PCR检测KPNA4 mRNA显示示，miR-567转染组KPNA4 mRNA相对表达量为0.35±0.045；Western blot显示，miR-567转染组KPNA4蛋白相对表达量为0.43±0.079、caspase-3蛋白相对表达量为3.70±0.29、Bax蛋白相对表达量为3.35±0.21，差异均有统计学意义（均P＜0.05）（图4）。
图3 细胞划痕实验检测miR-567过表达对Panc-1细胞迁移的影响
Figure 3 Determination of in fl uence of miR-567 overexpression on migration of Panc-1 cells by scratch wound healing assay
图4 KPNA4、caspase-3及Bax表达检测
Figure 4 Detection of expressions of KPNA4 and apoptosis-associated proteins
3 讨 论
胰腺癌是一种高度侵袭性恶性肿瘤，患者常无明显症状，诊断时多处于晚期且常伴有淋巴结、远处转移、血管侵泛等[8]。miRNA表达失调普遍存在于在肿瘤中，包括胰腺癌[8]。比如，miR-200基因簇过表达阻碍卵巢癌细胞迁移，且可作为卵巢癌预后的标志物[9]。miR-128通过调控干细胞再生因子Bmi-1，抑制胶质瘤增殖和自我更新[10]。miR-17-5p通过抑制AIB1 mRNA的翻译，进而调控乳腺癌细胞增殖[11]。多顺反子miRNA簇miR-17-92在肺癌中过表达，能促进细胞增殖[12]。因此，探索失调miRNA的功能对于了解胰腺癌分子发生机制非常关键。研究发现，miR-567在G3级乳腺癌患者中表达低于G1级，在预后差的患者中表达低于预后较好的患者，且过表达后能显著抑制肿瘤生长、增殖和迁移[7]。本研究发现miR-567在胰腺癌细胞系中的表达显著低于正常胰腺细胞系，意味着miR-567可能作为抑癌基因参与胰腺癌发生发展过程。通过对慢病毒介导的miR-567过表达的生物学行为分析，发现Panc-1细胞的增殖和迁移能力受到显著抑制，并可促进细胞凋亡，由此证实miR-567在胰腺癌和乳腺癌中发挥类似的抑癌作用。
Bertoli等[7]还发现miR-567是核转运受体蛋白KPNA4的负调控因子，通过调控KPNA4基因的表达控制乳腺癌细胞增殖和转移。为探讨KPNA4与miR-567在胰腺癌中的关联，本研究采用qRT-PCR及Western blot检测了KPNA4的mRNA和蛋白表达水平，结果显示KPNA4基因转录和翻译水平受miR-567过表达的影响而下调。这表明，在胰腺癌中，miR-567也是KPNA4的负调控因子，推测miR-567过表达对胰腺癌细胞增殖和迁移的抑制作用也是通过降低KPNA4的表达实现的。研究[13]报道，前列腺癌KPNA4敲除后，显著降低前列腺癌细胞迁移能力，同时前列腺癌小鼠模型的瘤体侵袭和远端转移能力也受到明显抑制。这更进一步表明，KPNA4是作为促癌基因参与多种肿瘤发生发展过程，包括乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌。
KPNA4能介导细胞核转录因子κB（NF-κB）从细胞质转运到细胞核，激活NF-κB响应基因[14]。NF-κB转录因子广泛参与多种生物学响应，在调节免疫反应和炎症方面起重要作用[15]。但越来越多的研究发现，NF-κB在多种人类恶性肿瘤中异常表达或活化，参与调控细胞增殖、转移、凋亡等多种生物过程相关的基因表达[16]。NF-κB信号途径受抑制将导致一系列抗凋亡蛋白的表达受损，如Bcl、细胞凋亡抑制蛋白2及Bcl-xL[17]。研究[18]发现，NF-κB在前列腺癌细胞中失活与血管生成、侵袭、转移受抑有密切关系。NF-κB活性与裸鼠人黑色素瘤肿瘤模型的生长、血管生成、转移相关[19]。另外，在血管内皮细胞中，miR-181b通过靶向KPNA4成为下游NF-κB信号通路的调节因子[20]。在本研究中，miR-567可能也像miR-181b那样通过调控KPNA影响NF-κB信号通路的转导，笔者推测NF-κB的核转位过程因KPNA4低表达而受到阻碍，扰乱一系列增殖、转移及抗凋亡基因的表达，从而有助于抑制胰腺癌细胞增殖和转移。
之前的研究还发现，KPNA4通过调控肿瘤微环境中肿瘤坏死因子TNF-α和TNF-β介导的细胞因子的相互作用，从而促进前列腺癌的转移[13]。笔者猜测，miR-567在胰腺癌中过表达后，由于KPNA4表达水平的降低，降低了TNF-α和TNF-β的分泌，影响了它们介导的细胞因子调控网络，改变肿瘤微环境，因而有助于抑制胰腺癌细胞增殖和转移。
细胞凋亡途径包括两条，即由肿瘤坏死因子受体1及TRAIL-R1等死亡受体介导的外源性途径[21]，及由各种刺激所导致的线粒体外膜通透性改变的内源性途径[22]。而caspase-3、caspase-8为两条途径的共同执行者，当细胞发生凋亡时，DNA修复终止，核酸内切酶得以活化，DNA发生裂解，细胞骨架蛋白破坏，细胞形态失去正常。BAX亚家族起促凋亡的作用，主要包括BAK和BAX[23]。caspase-3和BAX作为细胞凋亡的标志物，在凋亡过程中上调表达，本研究发现，miR-567过表达后，caspase-3和BAX上调表达，其凋亡的机制可能是通过上调caspase-3和BAX而实现的。
本研究也存在着一些不足之处，比如miR-567-KPNA4介导的下游肿瘤相关信号通路如何，miR-567与胰腺癌患者无瘤生存率、总生存率及预后的关系如何，在基因敲除鼠中的动物实验结果如何，都值得进一步研究。
综上，miR-567在胰腺癌细胞系中低表达，miR-567高表达可抑制胰腺癌细胞增殖和迁移，并诱导凋亡，其机制可能与下调KPNA4及上调caspase-3和BAX表达有关，这可能为将来开发新的诊断和预后标志物、研发新的肿瘤靶向药物提供一定的思路。
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