原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率居世界第6位，致死率居世界第2位[1]。现阶段，尽管HCC的诊疗技术较前已有一定的提高，但HCC早期诊断困难、易复发、易转移等特点仍使得HCC患者的整体预后欠佳[2]。因此，深入研究HCC潜在的发生、发展机制，对于提升HCC的诊治水平以及改善患者的预后有着重要意义。
微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度约为22个核苷酸的内源性非编码RNA分子，其可在转录后水平与mRNA特异性结合下调靶基因的表达。诸多研究[3-4]表明，miRNA的异常表达与肿瘤的发生、发展及预后密切相关，具有癌基因或抑癌基因的功能。已有研究发现，miR-1180在多种实体肿瘤中存在异常表达，且呈现出一定的组织或肿瘤特异性。例如，miR-1180在肺癌和胰腺癌中表达上调，能促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并与肺癌患者TNM分期和不良预后密切相关；但miR-1180在膀胱癌中却呈现低水平表达，发挥着抑癌基因的作用[5-7]。目前，miR-1180与HCC的相关性研究鲜有报道，故本研究基于GEO（Gene Expression Omnibus）和TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库来探讨miR-1180在HCC组织中的表达情况及其临床意义，并对miR-621靶基因进行系统的生物信息学分析，以期为寻找新型HCC诊断标志物或治疗靶点提供依据。
1 资料与方法
1.1 数据来源
本研究自GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载了数据集GSE36915 miRNA表达数据，包含68例HCC组织，21例癌旁组织。从TCGA数据库（https://cancergenome.nih.gov/）中下载了377例HCC组织样本和50例癌旁组织样本的miRNAseq、mRNAseq表达谱和临床数据（3级数据），其中371例患者具有匹配的miRNA表达谱和临床数据，365例患者具有匹配的miRNA表达谱、mRNA表达谱和临床数据。
1.2 方法
1.2.1 差异表达分析 利用R（The Project for Statistical Computing）edgeR 包 [8]（http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html）分别对miRNA和mRNA表达谱进行过滤、归一化处理，筛选HCC组织与癌旁组织之间差异表达mRNA和miRNA（筛选标准：|log2差异倍数 |＞1，P＜0.05）。标准化后的 miRNA 和mRNA表达值以每100万标记读本中外显子的读本数（counts of exon model per million mapped reads，CPM）表示，并经log2转化后用于后续分析。
1.2.2 患者分组 提取TCGA数据库371例HCC患者匹配的miR-1180表达谱和预后数据，使用X-tile3.6.1（Yale University School of Medicine，New Haven，CT，USA）软件 [9]基于Kaplan-Meier法及Log-rank检验确立最佳截断值7.05，将患者分为miR-1180低表达组（n=250）和miR-1180高表达组（n=121）。
1.2.3 miR-1180靶基因预测及功能分析 使用 DIANA-microT（http:// diana.imis.athenainnovation.gr）、TargetScan v7.1（http://www.targetscan.org）、MiDRB（http://www.mirdb.org/）3个数据库联合（取交集）预测miR-1180靶基因；利用miRwalk（http://129.206.7.150/）、Tarbase（http://carolina.imis.athena-innovation.gr）、miRTraBase（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw）3个数据库检索（取并集）已被实验所证实的miR-1180靶基因。两者的合集与HCC组织中差异低表达基因集合的交集即为本研究所确立的miR-1180靶基因集合。进而，利用在线 工 具 DAVID（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）对miR-1180靶基因进行基因本体论（Gene ontology，GO） 及 KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析。GO富集分析包括生物过程（biological process，BP）、细胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3个部分。
1.2.4 关键靶基因筛选 利用在线工具STRING[10]（https://string-db.org）联合Cytoscape软件[11]构建miR-1180靶基因蛋白互作网络，并运用CytoHubba插件依据连接度（degree）筛选出前30位关键基因（hub gene）。提取365例HCC患者关键基因的表达谱及预后数据，采用X-tile 3.6.1软件筛选预后风险基因，确立最佳截断值并绘制Kaplan-Meier曲线。
1.3 统计学处理
采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料采用独立样本t检验。受试者工作特征曲线（ROC）用于评价指标诊断效能，计算曲线下面积（area under the curve，AUC）。生存分析采用Kaplan-Meier法及Log-rank检验，并运用Cox比例风险回归模型分析影响患者预后的危险因素，计算风险比（hazard ratio，HR）及其95%可信区间（confidence interval，CI）。结局指标采用患者总生存期（overall Survival，OS），即术后病理确诊之日起至患者因任何原因死亡的间隔时间。以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 HCC组织与癌旁组织miR-1180差异表达分析
GSE36915数据集与TCGA数据集的分析结果一致显示miR-1180在HCC组织中较癌旁组织差异高表达（均P＜0.0001），且对于HCC具有良好的诊断效能（GSE36915：AUC=0.8 704，P＜0.0 001；TCGA：AUC=0.8 450，P＜0.0 001）（图1）。
图1 miR-1180在HCC组织及癌旁组织中表达量及其诊断HCC的ROC曲线
Figure 1 Expression levels of miR-1180 in HCC tissues and adjacent liver tissues, and ROC curves of miR-1180 for diagnosis of HCC
2.2 miR-1180表达与HCC患者临床特征的关系
回顾性分析371例HCC患者miR-1180表达量与临床特征关系，结果显示miR-1180的表达水平与患者年龄、肿瘤家族史、肿瘤分化程度、AFP等密切相关（均P＜0.05），而与性别、TNM分期、纤维化评分、Child-Pugh分级、血管侵犯等指标无明显关系（均P＞0.05）（表1）。
表1 HCC患者miR-1180表达量与临床病理参数之间的关系
Table 1 Relations of miR-1180 expression with clinicopathologic factors of the HCC patients
参数 n（%） miR-1180表达量 t P 参数 n（%） miR-1180表达量 t P确诊年龄（岁） 纤维化评分≤65 233（62.8） 6.654±1.148 2.067 0.039 0～4 135（36.4） 6.444±1.053＞65 138（37.2） 6.409±1.024 5～6 79（21.3） 6.498±0.887 -0.382 0.703性别 缺失 157（42.3） —男252（67.9） 6.496±1.112 -1.702 0.090 Child-Pugh 分级女119（32.1） 6.705±1.09 A 219（59.0） 6.613±0.986肿瘤家族史 B～C 22（5.9） 6.438±1.061 0.789 0.431无210（56.6） 6.280±0.983-3.279 0.001缺失 130（35.0） —有110（29.6） 6.690±1.100 血管侵犯缺失 51（13.7） — 无 206（55.5） 6.507±1.025 TNM分期 有 110（29.6） 6.646±1.193 -1.084 0.279 I～II 257（69.3） 6.543±1.042 缺失 55（14.8） —III～IV 90（24.3） 6.735±1.276 -1.413 0.159 AFP缺失 24（6.5） — 阴性 150（40.4） 6.285±0.988分化程度 阳性 130（35.0） 6.947±1.075 -5.368 ＜0.001高～中 231（62.3） 6.437±1.130 缺失 91（24.5） —低～未 136（36.7） 6.797±1.028 -3.047 0.002缺失 4（1.1） —
2.3 HCC患者预后影响因素分析
Kaplan-Meier分析提示HCC组织中miR-1180高表达涉及HCC患者不良预后（P=0.0 012）（图2）。此外，单因素Cox回归分析表明miR-1180表达量、TNM分期、血清甲胎蛋白与HCC患者OS密切有关（均P＜0.05）；多因素Cox回归分析则进一步提示TNM分期（HR=1.734，95% CI=1.127～2.668，P=0.012）、miR-1180表达量（HR=1.692，95% CI=1.152～2.485，P=0.007）是影响HCC患者OS的独立危险因素（表2）。
图2 不同miR-1180表达量HCC患者的生存曲线
Figure 2 Survival curves of HCC patients with different miR-1180 expression levels
表2 HCC患者总体生存率影响因素的Cox回归分析
Table 2 Cox regression analysis of factors affecting overall survival in HCC patients
参数 单因素分析 多因素分析HR（95% CI） χ2 P HR（95% CI） χ2 P miR-1180（高表达） 1.768（1.247～2.506） 10.239 0.001 1.692（1.152～2.485） 7.201 0.007确诊年龄（＞65岁） 1.266（0.892～1.797） 1.740 0.187 1.215（0.832～1.773） 1.015 0.314性别（女） 1.218（0.851～1.743） 1.161 0.281 1.050（0.713～1.546） 0.061 0.805肿瘤家族史（有） 1.173（0.809～1.700） 0.707 0.400 1.019（0.678～1.533） 0.008 0.927 TNM分期（III～IV） 2.503（1.721～3.640） 23.022 ＜0.001 1.734（1.127～2.668） 6.277 0.012分化程度（低～未） 1.098（0.765～1.576） 0.257 0.612 1.202（0.807～1.790） 0.817 0.366纤维化评分（5～6） 0.825（0.482～1.414） 0.489 0.484 1.279（0.724～2.258） 0.719 0.396 Child-Pug分级（B～C） 1.661（0.821～3.358） 1.995 0.158 1.879（0.894～3.950） 2.766 0.096血管侵犯（有） 1.336（0.881～2.025） 1.858 0.173 1.058（0.679～1.650） 0.063 0.802甲胎蛋白（阳性） 1.706（1.103～2.638） 5.773 0.016 1.245（0.763～2.032） 0.770 0.380
2.4 miR-1180靶基因预测及功能分析
miR-1180有两种成熟体形式：miR-1180-3p和miR-1180-5p，分别来源于miR-1180前体的3'端和5'端。本研究共筛选获得miR-1180靶基因169个，其中miR-1180-3p靶基因39个，miR-1180-5p靶基因137个。富集分析提示miR-1180-3p的靶基因主要富集于脂质运输、上皮细胞迁移调控等生物过程（BP），低密度脂蛋白颗粒结合等分子功能（MF），以及乙醛酸和二羧酸代谢通路（KEGG）。miR-1180-5p主要富集于细胞雌二醇刺激应答、细胞迁移调控等生物过程（BP），肝素结合、钙离子结合等分子功能（MF），以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、补体级联、脂肪酸降解等通路（KEGG）（图3）。
2.5 miR-1180关键靶基因筛选
结合蛋白互作网络和预后分析结果，本研究共筛选出6个miR-1180关键靶基因：过氧化物酶增殖激活受体γ辅激活蛋白1α（peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator 1 α，PPARGC1A）、乙醛脱氢酶2（aldehyde dehydrogenase 2 family，ALDH2）、肌氨酸脱氢酶（sarcosine dehydrogenase，SARDH）、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶2（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 2，HMGCS2）、雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）、E26转录因子2（ETS proto-oncogene 1 transcription factor，ETS2）；其中，ETS2为miR-1180-3p的靶基因；PPARGC1A、ALDH2、SARDH、HMGCS2、ESR1为miR-1180-5p的靶基因。上述6个基因在HCC组织中均呈现表达下调，且相对低表达者与不良预后密切相关（均P＜0.05）；比对miR-1180-3p/5p及上述靶基因序列，证实了miR-1180-3p/5p可与相应靶基因3'端非编码区（3'-UTR）结合（图4-5）。
图3 miR-1180靶基因的功能及通路富集分析
Figure 3 Functional and pathway enrichment analyses of the target genes of miR-1180
图4 miR-1180靶基因的蛋白互作网络图
Figure 4 The protein-protein interaction networks of the target genes of miR-1180
图5 miR-1180关键靶基因相关的生存曲线及miR-1180与其靶基因在3'-UTR的结合位点
Figure 5 Survival curves associated with the key target genes of miR-1180 and the binding sites of miR-1180 in the 3’-UTR of the target genes
3 讨 论
miRNA表达异常在肿瘤的发生、发展中发挥着重要作用，深入研究miRNA与肿瘤的相关性将有望为肿瘤的诊断及治疗提供新思路和新策略。已有研究发现，miR-1180在多种肿瘤组织或肿瘤细胞株中存在异常表达，且呈现出一定的组织或肿瘤特异性，发挥着癌基因（如肺癌、胰腺癌等）或抑癌基因（如膀胱癌等）的作用。例如，肺癌组织中高水平表达miR-1180与患者TNM分期及预后显著相关[5]；胰腺癌细胞中过表达miR-1180能下调靶基因TNIP2的表达，激活NF-κB信号通路，促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[6]；而膀胱癌细胞中miR-1180与抑癌基因P21均呈现低表达，若过表达miR-1180则能显著上调P21表达水平，抑制膀胱癌细胞的增殖[7]。因此，深入探讨miR-1180在不同肿瘤中的作用及其机制有着非常重要的意义。
目前，对于miR-1180在HCC组织中的表达水平及其作用尚不十分明确。Zhou 等[12-13]研究发现HCC组织（8例）及HepG2等HCC细胞株中miR-1180的表达水平较其癌旁组织及LO2正常肝细胞显著上调，且过表达miR-1180可显著下调其靶基因TNIP2、OTUD7B的表达，激活NF-κB信号通路，显著增强癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。考虑到上述研究存在样本量较少等不足，本研究首先基于GEO及TCGA数据库的大样本优势分析了miR-1180在HCC组织中的表达情况，证实了miR-1180在HCC组织中的表达水平较癌旁组织显著上调；另外，ROC曲线结果显示miR-1180表达量能较好地区分HCC组织和癌旁组织，提示了miR-1180具有作为HCC病理诊断标志物的潜在价值。
此外，本研究进一步探讨了HCC组织中miR-1180表达量与HCC患者临床病理指标及预后间的相关性。本研究发现miR-1180在低或未分化HCC组织中表达相对较高，且miR-1180表达量与肿瘤家族史相关，这提示了miR-1180密切涉及HCC的发生与发展。值得注意的是，本研究还发现HCC组织中miR-1180表达量与HCC患者血清甲胎蛋白表达呈正相关。已有研究证实，多种miRNA分子在肿瘤患者癌组织及血清中可同时存在表达异常，且具备一定的稳定性和组织特异性，例如miR-215[14]、miR-329[15]等。目前，笔者暂未发现miR-1180在HCC患者血清中表达量的相关研究，对于miR-1180能否成为一种新型HCC血清分子诊断标志物，以及能否联合AFP用于HCC患者的早期诊断有待进一步的研究阐明。此外，Kaplan-Meier分析提示HCC组织中高表达miR-1180与HCC患者不良预后有关，且多因素Cox回归分析证实miR-1180表达量是影响HCC患者预后的独立危险因素。因此，结合miR-1180的表达水平及其与临床病理指标和预后的相关性，推测miR-1180在HCC的发生、发展过程中主要发挥癌基因的作用。
基于miRNA-mRNA互作原理以及系统的生物信息学方法，我们还首次对miR-1180的靶基因进行了较为全面的预测并功能分析。富集分析提示miR-1180的靶基因主要富集于脂质代谢、细胞迁移、转录调控、细胞信号转导等功能，以及脂肪酸降解及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解等通路。诸多研究表明，脂质代谢紊乱是肿瘤代谢的重要特征之一，一方面脂质代谢为肿瘤细胞的异常增殖供给大量能量；另一方面多种脂质分子是细胞膜、脂质信号分子的重要组分，参与诸多肿瘤相关通路的信号转导，涉及肿瘤（包括HCC）的增殖、侵袭、转移、血管生成等生物学过程[16-17]。目前，笔者暂未发现miR-1180参与调控脂质代谢的相关研究，深入研究miR-1180、脂质代谢、HCC三者间的相关性无疑具有广阔前景。
为进一步揭示miR-1180在HCC中的作用机制，本研究结合靶基因蛋白互作网络及预后分析筛选出6个miR-1180潜在关键靶基因，分别为ETS2、PPARGC1A、ALDH2、SARDH、HMGCS2、ESR1；其中PPARGC1A、ALDH2、HMGCS2、ESR1为脂质代谢调控相关基因。现有研究表明，PPARGC1A、ALDH2、HMGCS2、ESR1等4个关键靶基因与HCC的发生、发生过程密切相关。与本研究结果一致，相关研究已发现PPARGC1A、ALDH2、HMGCS2、ESR1等基因在HCC中均呈现低表达，且与患者不良预后有关；此外，当上调HCC细胞株中上述基因的表达水平则可通过调控相关信号通路（如AMPK信号通路、转录因子SP1等）显著抑制HCC细胞的增殖、迁移或侵袭等生物学过程，提示了PPARGC1A、ALDH2、HMGCS2、ESR1在HCC的发生、发展中发挥抑癌基因的作用[18-22]。目前，ETS2、SARDH与HCC关系的研究鲜有报道。作为MAPK/ERK通路的重要底物之一，ETS2的异常表达与多种肿瘤关系密切，且所起作用具有一定的组织特异性，发挥着癌基因（如喉癌等）或抑癌基因（如肺癌等）的作用[23-24]。SARDH是调控肌氨酸代谢的关键酶之一，其异常表达同样涉及肿瘤的发生与发展。Lim等[25]发现SARDH在HCC组织中较正常肝组织低表达，提示SARDH与HCC的发生、发展紧密相关，但具体作用及机制尚不明确。Khan等[26]发现SARDH在前列腺癌中低表达，当过表达SARDH则可显著抑制癌细胞的增殖能力，发挥抑癌基因的作用。结合本次研究靶基因差异表达分析和预后分析结果，推测ETS2和SARDH在HCC中同样作为抑癌基因而存在。基于上述研究结果及文献复习，我们认为HCC中miR-1180高表达可诱导其关键靶基因（ETS2、PPARGC1A、ALDH2、SARDH、HMGCS2、ESR1等）表达水平的异常上调，并由此促进HCC的发生和发展。
综上所述，本研究基于GEO和TCGA数据库合并系统的生物信息学方法揭示了miR-1180可作为一种促癌基因参与HCC的发生、发展，并拥有作为HCC诊断标志物、预后指标及治疗靶点的潜在应用价值。总之，本次生物信息学分析将有望为日后HCC发病机制的研究以及诊治方法的改善提供新策略、开辟新路径，但miR-1180及其靶基因在HCC中作用及其机制还有待后续实验予以证实及丰富。
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