肝细胞癌是世界最常见的肿瘤之一，也是全球癌症病死率第二的恶性肿瘤。中国是人口大国，也是肝细胞癌大国，全球每年新发肝细胞癌病患中约有一半以上出自中国[1-2]。迄今为止，外科切除仍是肝细胞癌最有效的治疗方法，但术后复发是影响治疗效果的重要因素[3]。根据复发时间，术后复发可分为早期复发（术后2年内）和晚期复发（2年后）[4-5]。术后早期复发严重影响肝细胞癌患者的预后，肝细胞癌术后2年内死亡的主要原因是肿瘤的早期复发[6]。因此，本研究主要探讨影响肝细胞癌患者术后早期复发的危险因素，为预测复发风险、改善预后提供依据。
1 资料与方法
1.1 研究对象
回顾性分析2011—2016年华中科技大学同济医学院附属同济医院就诊的225例肝细胞癌患者。纳入标准：(1)年龄1 8 ～7 5 岁，性别不限； (2) 临床诊断为肝细胞癌， 巴塞罗那分期（Barcelona Clinic Liver Cancer，BCLC）A或B期， 行根治性肝切除；(3)Child-Pugh肝功能分级为 A级，或B级但经护肝治疗后恢复至A级；(4) 不伴随其他的恶性疾病；(5) 无严重的心、肺、脑等器官的器质性疾病；⑹ 临床资料齐全；⑺ 自愿签署知情同意书。排除标准：(1) 孕妇及哺乳期妇女；(2) 有器官移植病史；(3)术前行其它抗肿瘤治疗及免疫治疗；(4) 药物滥用者，或患有可能干扰研究依从性的心理或精神等疾病；(5) 无法获得随访资料；⑹ 研究者认为不适合本研究的其它情况。
1.2 分析指标
早期复发患者例数；患者各项基线指标：性别、年龄、肿瘤最大径、肿瘤个数、肝功能分级、HBV-DNA、甲胎蛋白（AFP）水平、血小板计数（PLT）、碱性磷酸酶（ALP）水平、中性粒细胞-淋巴细胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）水平、肝切除方式及术中输血与肝门阻断与否等。
1.3 随访
术后半年内每1个月1次，术后2年内每3个月1次。术后3～5年每6个月1次，术后5年以上每1年1次，直至死亡或失访。随访包括体格检查、肿瘤标志物和肝脏影像学检查（肝脏超声、肝脏CT或MRI）。同时每年进行1次胸部CT平扫。
1.4 统计学处理
通过Epidata 3.0建立数据库，应用SPSS 26（IBM）进行数据分析。分类变量用实际频数表示，定量资料用中位数及四分位数来描述。Logistic 回归模型确定独立危险因素，ox 回归模型建立预测模型。运用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）及曲线下面积（area under curve，AUC）评价预测效能。以α=0.05（双侧）作为检验水平。
2 结 果
2.1 患者早期复发情况及其他基线资料
225例患者中，130例患者在术后2年内复发（早期复发），占57.8%。男179例，占79.6%；中位年龄52岁。201例患者入院时Child-pugh分级为A级，24例患者入院时Child-pugh分级为B级，但经护肝治疗后恢复至A级。肿瘤中位最大径为 3.4（2.4～4.75）cm，191例患者为单发肿瘤，34例患者为多发肿瘤。其他基线资料见表1。
2.2 术后早期复发的危险因素
单因素Logistic回归分析显示肿瘤最大径、肿瘤数目、γ-G T、NLR 与术后早期复发有关（均P＜0.05）。多因素Logistic回归分析显示肿瘤数目（HR=2.737，9 5% C I=1.63 ～7.047，P=0.37）、γ-GT（HR=1.016，95% CI= 1.008～1.024，P＜0.001）、NLR（HR=1.355，95% CI=1.013～1.812，P=0.041）为肝细胞癌术后早期复发的独立危险因素（表2）。
表1 225例肝细胞癌患者的基线资料
Table 1 Baseline characteristics of the 225 HCC patients
项目 数值性别[n（%）] 男 179（79.6） 女 46（20.4）年龄[岁，M（IQR）] 52（45～59）肿瘤最大径[cm，n（%）] ＞5 51（22.7） ≤5 174（77.3）肿瘤个数[n（%）] 单发 191（84.9） 多发 34（15.1）Child-Pugh 分级[n（%）] A 201（89.3） B 24（10.7）HBV-DNA [n（%）] 阳性 151（67.1） 阴性 74（32.9）AFP [ng/mL，M（IQR）] 63.5（8.1～841.1）PLT [109/L，M（IQR）] 78.3（51.2～102）ALP[U/L，M（IQR）] 78（61～99）NLR [M（IQR）] 1.85（1.41～2.61）γ-GT [U/L，M（IQR）] 53（33～94）肝切除方式[n（%）] 段叶切除 57（25.3） 局部切除 168（74.7）术中输血[n（%）] 是 52（23.1） 否 173（76.9）肝门阻断[n（%）] 是 61（27.1） 否 164（72.9）
表2 影响肝细胞癌患者早期复发的单因素和多因素分析
Table 2 Univariate and multivariate analysis of factors for early recurrence in HCC patients
因素 单因素分析 多因素分析HR（95% CI） P HR（95% CI） P性别（男vs.女） 0.603（0.314～1.156） 0.128 — —年龄（＞50 岁vs.≤50 岁） 1.117（0.657～1.900） 0.682 — —肿瘤最大径（＞5 cm vs.≤5 cm） 2.043（1.043～4.000） 0.037 1.878（0.886～3.981） 0.1肿瘤个数（多发vs.单发） 3.295（1.369～7.934） 0.008 2.737（1.063～7.047） 0.037 HBV-DNA（阳性vs.阴性） 0.902（0.513～1.587） 0.721 — —AFP（＞400 ng/mL vs.≤400 ng/mL） 1.492（0.843～2.642） 0.169 — —PLT（每增加1 个单位） 1.006（0.997～1.015） 0.198 — —ALP（每增加1 个单位） 0.997（0.990～1.005） 0.471 — —γ-GT（每增加1 个单位） 1.017（1.009～1.025） ＜0.001 1.016（1.008～1.024） ＜0.001 NLR（每增加1 个单位） 1.301（1.014～1.670） 0.039 1.355（1.013～1.812） 0.041 Child-Pugh 分级（A vs.B） 1.715（0.732～4.016） 0.214 — —肝切除（段叶切除vs.局部切除） 1.350（0.727～2.505） 0.342 1.605（0.812～3.172） 0.173术中输血（是vs.否） 0.542（0.290～1.012） 0.055 0.503（0.252～1.005） 0.052肝门阻断（是vs.否） 1.072（0.590～1.948） 0.819 0.806（0.405～1.601） 0.537
2.3 γ-GT、NLR 预测早期复发的ROC 曲线分析
γ-GT预测预后的AUC为67.6%（95% CI= 60.7%～74.5%），最佳截断值为108 U/L，其敏感度和特异度分别为34.6%和96.8%。NLR预测预后的AUC为59.1%（95% CI=51.6%～66.6%），最佳截断值为2.11，其敏感度和特异度分别为5 2.3%和6 5.3%。利用SPSS软件建立γ-GT和NLR联合指标，该指标AUC为70.4%（95% CI= 63.6%～77.1%），最佳截断值为0.57，其敏感度和特异度分别为52.3%和81.1%。γ-GT&NLR联合指标预测肿瘤复发优于单一指标（图1）。
图1 γ-GT、NLR 以及γ-GT 与NLR 联合预测肝细胞癌患者术后早期复发的ROC 曲线
Figure 1 ROC curves of γ-GT, NLR and γ-GT plus NLR in predicting early postoperative recurrence in HCC patients
2.4 评分系统建立
分别将NLR 、γ-GT、肿瘤个数纳入回归方程， 得到复发风险函数：Y=0.254X1+0.016X2+0.973X3-1.390，X1、X2、X3分别代表NLR、γ-GT、肿瘤数目。根据HR值，将γ-GT＞108 U/L赋值为1，NLR＞2.11赋值为2，肿瘤个数＞1赋值为3，否则赋值为0。可得危险评分界值为0 ～6 分。＜3 分为低危组，≥3 分为高危组。Kaplan-Meier曲线分析低危组1、3、5年的无病生存率分别为76.9%、44.5%和32.8%，而高危组为33.4%、20.1%和6.69%，两组差异有统计学意义（P＜0.001）（图2）。
图2 高危组与低危组Kaplan-Meier 生存曲线
Figure 2 Kaplan-Meier survival curves for high-risk group and low-risk group
3 讨 论
肝细胞癌切除术后5年内复发率高达70%，并且大多数在术后2年内长出新的病灶[7]。早期复发（＜2年）多表现为局部浸润、肝内播散和肿瘤自身生物学特征改变[8]，肝癌术后早期复发是导致患者预后不良的重要因素。因此有效预测早期复发的指标将对患者的危险分层具有重要意义。
NLR 是癌症患者术后病死率的有效预测因子。术前NLR水平可以预测肝切除以及肝移植术后肝癌患者的无病生存率（disease-free survival，DFS）及总生存率（overall survival，OS）[9-10]。研究[11]表明中性粒细胞分泌大部分血管内皮生长因子，这是一种已知的参与肿瘤发展的促血管生成因子。此外，中性粒细胞通过产生精氨酸酶，一氧化氮和活性氧而抑制淋巴细胞、自然杀伤细胞和活化的T细胞的细胞毒活性，因此具有免疫抑制性[12]。由于肿瘤刺激，与肿瘤相关的巨噬细胞活性增加，导致中性粒细胞增多和/或淋巴细胞减少[13-15]。淋巴细胞介导抗肿瘤免疫，淋巴细胞减少提示肿瘤特异性T细胞数量减少[16]。NLR反映中性粒细胞与淋巴细胞的相对比例，高NLR水平意味着淋巴细胞少于中性粒细胞，淋巴细胞减少，可能导致淋巴细胞对恶性肿瘤的免疫反应较差，从而影响预后，增加肿瘤复发的风险[17-19]。另外，术前NLR值对微血管浸润（microvascular invasion，MVI）具有预测价值[20]。NLR截断值目前没有达成一致。Kim等[18]研究报道的NLR截断值为2.0，而Hung等[21]报道的NLR截断值为2.5。Gomez等[22]发现术前NLR≥5是无病生存期和总生存期的不良预测指标。本研究发现NLR是术后早期复发的独立危险因素，预测截断值为2.1。不同研究者确立的NLR截断值存在较大差异，这可能需要大样本、多中心、前瞻性研究来进一步探讨。
肝功能检查是广泛用于临床的血液测定，其中γ-GT的水平反映肝细胞的损伤程度，与细胞完整性或与胆道疾病有关[23]。一些研究[24-25]表明γ-GT升高可以造成DNA损伤、促进肿瘤进展、转移，提示恶性肿瘤患者的无病生存期较短[26-28]。此外，肝切除后血清γ-GT水平能预测肝癌患者的预后[29-30]。本研究发现术前血清γ-GT是术后早期复发的独立危险因素，其预测截断值为108 U/L。
联合NLR和γ-GT可用作肝癌的早期复发的预测因子，可提高单一指标的预测能力。为了减少混杂因素影响肝细胞癌患者的生存和复发，本研究将其他危险因素（如肿瘤大小，肿瘤数目等）纳入Logistic回归分析，发现肿瘤是否多发也是影响预后的重要因素。肿瘤数目越多，提示肿瘤呈多中心发展，因而这类患者更易复发和转移[31]。相较于影像学检查成本昂贵、具有辐射危害、肝硬化背景下微小结节性质难定，NLR、γ-GT是血常规和肝功能的常见指标，简单易得，再联合肿瘤数目，可对肝细胞癌患者早期复发进行危险分层。
本研究有几个局限性需要解决。一方面，由于NLR、γ-GT值是一个动态变化的过程，本研究仅使用基线值来预测结果，因此可能会遗漏很多信息。另外本文是一篇回顾性研究，且样本量较小，可能存在选择偏倚。本研究结果仍需要大规模、多中心前瞻性研究来验证。
[1] Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al.Global cancer statistics, 2012[J].CA Cancer J Clin, 2015, 65(2):87-108.doi:10.3322/caac.21262.
[2] Chen W, Zheng R, Baade PD, et al.Cancer statistics in China, 2015[J].CA Cancer J Clin, 2016, 66(2):115-132.doi:10.3322/caac.21338.
[3] Shim JH, Jun MJ, Han S, et al.Prognostic nomograms for prediction of recurrence and survival after curative liver resection for hepatocellular carcinoma[J].Ann Surg, 2015, 261(5):939-946.doi:10.1097/SLA.0000000000000747.
[4] Imamura H, Matsuyama Y, Tanaka E, et al.Risk factors contributing to early and late phase intrahepatic recurrence of hepatocellular carcinoma after hepatectomy[J].J Hepatol, 2003, 38(2):200-207.doi: 10.1016/s0168-8278(02)00360-4.
[5] Wu JC, Huang YH, Chau GY, et al.Risk factors for early and late recurrence in hepatitis B-related hepatocellular carcinoma[J].J Hepatol, 2009, 51(5):890-897.doi:10.1016/j.jhep.2009.07.009.
[6] European Association for the Study of the Liver.EASL Clinical Practice Guidelines: Management of hepatocellular carcinoma[J].J Hepatol, 2018, 69(1):182-236.doi:10.1016/j.jhep.2018.03.019.
[7] Dhir M, Melin AA, Douaiher J, et al.A Review and Update of Treatment Options and Controversies in the Management of Hepatocellular Carcinoma[J].Ann Surg, 2016, 263(6):1112-1125.doi:10.1097/SLA.0000000000001556.
[8] Poon RT, Fan ST, Ng IO, et al.Different risk factors and prognosis for early and late intrahepatic recurrence after resection of hepatocellular carcinoma[J].Cancer, 2000, 89(3):500-507.
[9] Okamura Y, Sugiura T, Ito T, et al.Neutrophil to lymphocyte ratio as an indicator of the malignant behaviour of hepatocellular carcinoma[J].Br J Surg, 2016, 103(7):891-898.doi:10.1002/bjs.10123.
[10] Liao W, Zhang J, Zhu Q, et al.Preoperative Neutrophil-to-Lymphocyte Ratio as a New Prognostic Marker in Hepatocellular Carcinoma after Curative Resection[J].Transl Oncol, 2014, 7(2):248-255.doi:10.1016/j.tranon.2014.02.011.
[11] Kusumanto YH, Dam WA, Hospers GAP, et al.Platelets and granulocytes, in particular the neutrophils, form important compartments for circulating vascular endothelial growth factor[J].Angiogenesis, 2003, 6(4):283-287.doi: 10.1023/B:AGEN.0000029415.62384.ba.
[12] Müller I, Munder M, Kropf P, et al.Polymorphonuclear neutrophils and T lymphocytes: strange bedfellows or brothers in arms?[J].Trends Immunol, 2009, 30(11):522-530.doi:10.1016/j.it.2009.07.007.
[13] Mano Y, Shirabe K, Yamashita Y, et al.Preoperative neutrophil-tolymphocyte ratio is a predictor of survival after hepatectomy for hepatocellular carcinoma: a retrospective analysis[J].Ann Surg, 2013, 258(2):301-305.doi:10.1097/SLA.0b013e318297ad6b.
[14] Pollard JW.Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis[J].Nat Rev Cancer, 2004, 4(1):71-78.doi:10.1038/nrc1256.
[15] Coussens LM, Werb Z.Inflammation and cancer[J].Nature, 2002, 420(6917):860-867.doi: 10.1038/nature01322.
[16] Schreiber RD, Old LJ, Smyth MJ.Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion[J].Science, 2011, 331(6024):1565-1570.doi: 10.1126/science.1203486.
[17] Motomura T, Shirabe K, Mano Y, et al.Neutrophil-lymphocyte ratio reflects hepatocellular carcinoma recurrence after liver transplantation via inflammatory microenvironment[J].J Hepatol, 2013, 58(1):58-64.doi:10.1016/j.jhep.2012.08.017.
[18] Kim WJ, Lim TW, Park PJ, et al.Prognostic markers affecting the early recurrence of hepatocellular carcinoma with liver cirrhosis after curative resection[J].Int J Biol Markers, 2019, 34(2):123-131.doi:10.1177/1724600819834306.
[19] 邱康华.中性粒细胞/淋巴细胞比值与肝脏疾病关系的临床研究进展[J].赣南医学院学报, 2019, 39(1):101-104.doi:10.3969/j.issn.1001-5779.2019.01.027.
Qiu KH.Clinical research progress in the relationship between neutrophil-to-lymphocyte ratio and liver diseases[J] Journal of Gannan Medical University, 39(1):101-104.doi:10.3969/j.issn.1001-5779.2019.01.027.
[20] 任家书, 马秀现, 李健, 等.术前中性粒细胞/淋巴细胞比值对小肝癌患者并发微血管浸润的预测价值[J].中国普通外科杂志, 2018, 27(7):840-846.doi:10.3978/j.issn.1005-6947.2018.07.007.
Ren JS, Ma XX, Li J, et al.Value of preoperative neutrophil to lymphocyte ratio for prediction of microvascular invasion in patients with small hepatocellular carcinoma[J] Chinese Journal of General Surgery, 2018, 27(7):840-846.doi:10.3978/j.issn.1005-6947.2018.07.007.
[21] Hung HC, Lee JC, Cheng CH, et al.Impact of neutrophil to lymphocyte ratio on survival for hepatocellular carcinoma after curative resection[J].J Hepatobiliary Pancreat Sci, 2017, 24(10):559-569.doi:10.1002/jhbp.498.
[22] Gomez D, Farid S, Malik HZ, et al.Preoperative neutrophil-tolymphocyte ratio as a prognostic predictor after curative resection for hepatocellular carcinoma[J].World J Surg, 2008, 32(8):1757-1762.doi:10.1007/s00268-008-9552-6.
[23] Whitfield JB.Gamma glutamyl transferase[J].Crit Rev Clin Lab Sci, 2001, 38(4):263-355.doi: 10.1080/20014091084227.
[24] Corti A, Duarte TL, Giommarelli C, et al.Membrane gammaglutamyl transferase activity promotes iron-dependent oxidative DNA damage in melanoma cells[J].Mutat Res, 2009, 669(1-2):112-121.doi:10.1016/j.mrfmmm.2009.05.010.
[25] Kunutsor SK.Gamma-glutamyltransferase-friend or foe within?[J].Liver Int, 2016, 36(12):1723-1734.doi:10.1111/liv.13221.
[26] Hanigan MH.Gamma-glutamyl transpeptidase: redox regulation and drug resistance[J].Adv Cancer Res, 2014, 122:103-141.doi:10.1016/B978-0-12-420117-0.00003-7.
[27] Luo C, Xu B, Fan Y, et al.Preoperative Gamma-Glutamyltransferase Is Associated with Cancer-Specific Survival and Recurrence-Free Survival of Nonmetastatic Renal Cell Carcinoma with Venous Tumor Thrombus[J].Biomed Res Int, 2017, 2017:3142926.doi:10.1155/2017/3142926.
[28] Grimm C, Hofstetter G, Aust S, et al.Association of gammaglutamyltransferase with severity of disease at diagnosis and prognosis of ovarian cancer[J].Br J Cancer, 2013, 109(3):610-614.doi:10.1038/bjc.2013.323.
[29] Nagasue N, Ono T, Yamanoi A, et al.Prognostic factors and survival after hepatic resection for hepatocellular carcinoma without cirrhosis[J].Br J Surg, 2001, 88(4):515-522.doi: 10.1046/j.1365-2168.2001.01732.x.
[30] 赵杰, 余海波, 朱运海, 等.肝癌根治术前GGT、ALT/AST和术后临床病理特征与预后的关系[J].中华普通外科杂志, 2019, 34(4):328-331.doi:10.3760/cma.j.issn.1007-631X.2019.04.011.
Zhao J, Yu HB, Zhu YH, et al.Preoperative GGT, ALT/AST relates to clinicopathological features and prognosis after radical surgery for hepatocellular carcinoma[J].Zhong Hua Pu Tong Wai Ke Za Zhi, 2019, 34(4):328-331.doi:10.3760/cma.j.issn.1007-631X.2019.04.011.
[31] 乐琪, 朱同恩, 莫志远, 等.原发性肝癌患者手术切除术后早期复发影响因素分析[J].中国普通外科杂志, 2019, 28(1):18-23.doi:10.7659/j.issn.1005-6947.2019.01.003.
Le Q, Zhu TE, Mo ZY, et al.Analysis of factors for early recurrence of patients with hepatocellular carcinoma after resection[J].Chinese Journal of General Surgery, 2019, 28(1):18-23.doi:10.7659/j.issn.1005-6947.2019.01.003.
