胰腺癌是世界范围内最致命的恶性肿瘤之一，预后极差，5年生存率仅为9%[1-2]。大部分患者因缺乏特定症状，诊断时即为晚期，而失去宝贵的手术治疗机会。临床上胰腺癌多通过影像学检查、生化检查进行诊断，通过组织活检确诊。影像学检查敏感度较低且高度依赖于病变的大小[3]；CA 19-9 是目前胰腺癌中最重要并且应用最广泛的一种生物标志物，但其低阳性预测值意味着它在无症状患者的大规模筛查中作用有限，而只适用于监测治疗反应和疾病复发的标志[4]。循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是肿瘤细胞凋亡、坏死释放或活性释放而释放出来的一部分循环游离DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA），携带肿瘤基因组的全部表观遗传特征[5]。近年来，ctDNA检测在胰腺癌的早期诊断、评估预后和化疗效果、指导靶向治疗中发挥越来越重要的作用。本文就ctDNA在胰腺癌中的临床应用进展进行综述。
1 ctDNA
1.1 ctDNA 简介
血液中含有多种生物物质，如循环细胞、血小板、细胞外小泡、mRNA、miRNA、蛋白质和cfDNA。在癌症患者的血液中，有一部分cfDNA是由肿瘤细胞通过凋亡、坏死或活性释放而释放出来的，这种DNA被称为ctDNA[6]。ctDNA只占据cfDNA总量的一小部分（＜1.0%），平均长度约＜180 bp（碱基对），浓度为3.6～5.0 ng/mL[7]，且在循环中的半衰期非常短，最多只有几个小时[8]。
一些解剖位置较为特殊的肿瘤，如胰腺癌解剖部位较深，肿瘤组织不易获取，传统组织活检方式存在一定的困难与风险。ctDNA可在血液和其他体液中检测到，如尿液、唾液、痰、粪便、胸膜液和脑脊液等[9]，因此它的取样涉及无创或微创手术，减少了传统组织活检的并发症，同时便于重复多次取样，以便于动态监测肿瘤的异质性，是传统组织活检很好的补充[10]。ctDNA可用于检测早期疾病，也可用于纵向监测肿瘤的基因组图谱，并在临床症状或进展的影像学证据出现之前检测晚期环境中基因改变的出现。因此，ctDNA分析可以指导临床决策，并通过与其他固体和液体活检技术的结合，最终使癌症的治疗个性化[11]。
1.2 ctDNA 检测技术
在体液样本中，因为ctDNA只占cfDNA的小部分， 所以需要高灵敏度的检测。目前已被普遍接受的新的测序技术，如数字聚合酶链反应（digital polymerase chain reaction，dPCR）和下一代测序（next generation sequencing，NGS），较传统的ctDNA定量方法，如分光光度法、比色DNA定量法和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）等，在检测敏感度和检测效率方面有了极大的提高。这些进展使得在基因组的广泛范围内检测超罕见的ctDNA突变成为可能[12-14]。
dPCR有着高灵敏度和靶点富集特点，为检测ctDNA中罕见的肿瘤突变提供了一个选择平台。尽管dPCR功能强大，但在单个试验中可检测的突变数量是有限的，不能检测未知突变。另一种方法NGS可以检测许多基因的多个突变，从而提高了单个样本的利用率[15]。但是，在检测ctDNA中的肿瘤突变方面，NGS敏感度目前不如dPCR，检测限制为0.1%～10%MAF，而基于dPCR的方法为0.001%[16]。同时dPCR比NGS有着更短的检测周期，意味着能够更加快速检测ctDNA的突变。这两种方法在流程上可能是互补的，例如NGS可用于分析原发肿瘤和识别感兴趣的核酸变异体，然后特异的突变可以通过特异的dPCR检测在血浆中捕获。但是这种工作流程可能无法在治疗过程或后续随访中识别新突变[9]，这有待进一步的探索。
虽然已经存在几种具有良好检测限的分析方法，但仍需开展工作，以开发可以重复使用、更便宜、操作更简单且能够在学术实验室之外实施的分析方法，或提高已具有这些特性的已有技术的分析灵敏度和特异度[17]。近年来，微流体技术在化学、生命科学等领域得到了广泛的应用。与微流体技术相结合的生物传感器将实验室中不同单元的操作整合在一块芯片上，具有先进的自动化和集成度。微流控芯片在ctDNA检测和分析方面具有巨大的潜力[18]。
2 ctDNA 在胰腺癌中的临床应用
2.1 DNA 突变检测
想要探索ctDNA在胰腺癌中的临床应用，首先要清楚胰腺癌患者中的ctDNA有着怎样的变化。Li等[19]对223例胰腺癌患者的血样进行ctDNA序列分析，共有152例（68.2%）患者从ctDNA中检测到至少一种可报告的基因组改变，经常改变的基因是KRAS（53.5%），其次是TP53（52.8%）和CDKN2A（15.1%）。其中KRAS突变患者中，87.0%的患者出现KRAS G12突变，分别为G12D（53.6%）、G12I（1.2%）、G12R（9.5%）和G12V（22.6%），其次为Q61H/L/R、V186I和N85H等突变。这些ctDNA中检测到的突变与胰腺癌患者的组织样本有着类似频率的基因组改变。沈璟等[20]回顾性分析接受根治性胰腺切除术并接受靶向测序分析的247例胰腺癌患者，研究发现K R A S 突变可能与肿瘤分化程度和病理T 分期相关，TP53突变可能与肿瘤分化程度和切缘相关，CDKN2A突变可能与性别相关。
这些研究有助于更好地了解胰腺癌患者的ctDNA谱，血源性ctDNA测序可被视为对组织检测有意义的补充，这就为探索ctDNA在胰腺癌中的临床应用提供了更有针对性的信息。最常见的ctDNA突变如KRAS突变等，可为胰腺癌的早期诊断和评估疗效等方面提供方向。此外，还可以从胰腺癌患者的ctDNA谱中发现特定的药物靶点，进行针对性的靶向治疗，进而实现个性化的精准医疗。目前来说仍需要更多大型的前瞻性临床研究，进一步构建和完善胰腺癌患者的ctDNA谱。
2.2 早期诊断
胰腺癌作为一类高致死性疾病，因起病隐匿、早期缺乏特定症状，大部分患者在被诊断时已经处于晚期，失去了根治性手术的机会[21]，所以胰腺癌的早期诊断显得尤为重要。但早期发现胰腺癌有很多挑战，包括它的无症状性、缺乏能够及时检测到较小病变的影像学检查以及迄今为止缺乏高敏感度和特异度的肿瘤标志物，如CEA、CA19-9等血清学肿瘤标志物升高虽然常见于恶性肿瘤患者，但是特异度较差，不能明确肿瘤的来源，且不能排除良性病变引起的相关标志物水平升高[14,22]。因此寻找稳定可靠且敏感度高特异度强的肿瘤标志物, 仍是胰腺癌早期诊断中需要解决与关注的问题[23]。
Cohen等[24]通过研究221例可切除胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）患者ctDNA的KRAS突变，以182例未发现癌症的患者作为对照组。在66例胰腺癌患者的血浆中检测到KRAS突变（30%），同时血浆中发现的每个突变都与随后在患者原发肿瘤中发现的突变完全一致（100%）。来自对照队列的182份血浆样本中，只有一份DNA或蛋白质生物标记呈阳性（99.5%的特异度）。这意味着ctDNA中的KRAS突变可能是一种有前途的胰腺癌诊断的生物标志物，但是单纯ctDNA的检测敏感度相对较低，这就大大影响了对胰腺癌的早期诊断。
Wang等[25]把突变体KRAS-ctDNA与CA19-9进行联合检测，发现其对胰腺癌（尤其是在早期癌症阶段）诊断的敏感度明显提高。Cohen等[24]尝试通过结合ctDNA的KRAS突变和CA19-9与其他蛋白质生物标记物进一步提高敏感度，通过试验筛选出另外三种蛋白生物标志物：癌胚抗原（carcinoem bryonic antigen，CEA）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN)。最终KRAS与四种蛋白质生物标记物结合使用可将敏感度由单独KRAS突变的30%提高到64%。这些研究都表明ctDNA和蛋白质生物标记物联合检测优于单一标记物，这为ctDNA应用于胰腺癌的早期诊断开拓了新的视野，但需要更多更大型的前瞻性研究来补充。
2.3 评估预后
目前胰腺癌患者预后评估主要靠影像学和蛋白质肿瘤标记物（如CA19-9、CEA等），但影像学检查有一定的延后性，不能及时反映患者病情的进展，蛋白质肿瘤标记物敏感度又较低，所以需要一种新的评估方式[26]。Strijker等[27]对58例未经治疗的转移性PDAC患者进行了回顾性分析，在26例（44.8%）样本中检测到ctDNA致病性突变，且检测到ctDNA与未检测到患者的中位总生存时间（overall survival，OS）相比明显缩短。Hadano等[28]分析了105例行胰十二指肠切除术的PDAC患者，33例（31%）血浆中检测到ctDNA。检测到ctDNA的患者中位OS持续时间比没有ctDNA的患者明显缩短，前者预后明显较差。这些研究结果显示血浆样本中ctDNA的存在可能是胰腺癌患者较差生存的一个重要而有力的评估因素，临床应用中可以评估患者预后，在治疗前或治疗中给予高危患者更多的综合治疗手段，有益于获得更高的效益。
2.4 评估化疗效果
化疗是改善中晚期胰腺癌患者预后的主要手段，及时评估化疗敏感度并根据结果调整化疗方案对于治疗尤为重要。Del Re等[29]对27例晚期PDAC并接受一线5-氟尿嘧啶、伊立替康和奥沙利铂或吉西他滨和纳布紫杉醇治疗的患者在开始化疗前（基线）和治疗第15天进行ctDNA分析，并且每次临床随访。19例患者在基线血浆样本中显示了KRAS突变。在第15天采集的样本中，ctDNA增加患者的无进展生存时间（progression-freesur vival，PFS）和OS明显缩短。这项研究表明ctDNA中的KRAS接受化疗前后的变化与胰腺癌化疗患者预后有关。Kruger等[30]研究54例接受吉西他汀化疗的晚期胰腺癌患者也发现，化疗期间突变体KRAS-ctDNA水平的降低是肿瘤对化疗敏感的早期指标，而CA19-9、CEA或CYFRA21-1的动态改变与化疗敏感度无显著相关。
这些研究都说明ctDNA分析可能作为一种新的化疗敏感度评估方式，可以根据ctDNA的变化评估化疗敏感度进而判断治疗效果，及时有针对性的调整治疗方案，从而可以获得更大治疗效果。同时因为ctDNA的半衰期比CA19-9的半衰期要短很多，大约为2 h，因此它更适合作为短期动力学的标记物[31]，意味着ctDNA水平的变化比蛋白质肿瘤标志物的变化更加迅速和明显，具有显著的优越性。但目前仍需要大规模的试验来形成标准的评估体系。
2.5 指导选择抗肿瘤药物
Li等[19]从胰腺癌患者的CTDNA中检测到几个潜在的药物靶点，如NTRK家族基因（拉罗替尼的靶点）和DNA损伤反应相关基因BRCA1和BRCA2（奥拉帕尼的靶点）。这些靶点基因可能将指导选择抗肿瘤药物。Drilon等[32]将55例TRK融合阳性的局部晚期或转移性肿瘤患者纳入研究并接受拉罗替尼治疗，总有效率为75%（95% CI= 61～85）。研究表明拉罗替尼在TRK融合阳性的癌症患者中具有显著且持久的抗肿瘤活性。Golan 等[33]将154例具有种系BRCA1或BRCA2突变以及转移性胰腺癌患者随机分组并试验干预（92例接受奥拉帕尼治疗，62 例接受安慰剂治疗）。试验结果显示在具有种系BRCA1或BRCA2突变以及转移性胰腺癌的患者中奥拉帕尼组的无进展生存期显着长于安慰剂组（7.4 个月vs.3.8 个月，P=0.004）。
美国临床肿瘤学会（Americ an Society of Clinical Oncology，ASCO）在最新指南中提出，对于转移性胰腺癌和已确认的种系BRCA突变患者，奥拉帕尼可能被推荐作为维持治疗的一种选择。对于存在NTRK1/2/3基因的肿瘤患者，建议使用拉罗替尼或恩特雷西替尼治疗[34]。除了以上基因靶点，Cheng等[35]在转移性胰腺癌患者的ctDNA中还发现了另外几种潜在的有临床意义的基因突变，如EGFR、KDR和ERBB2等等。一项三期临床试验证实，口服EGFR酪氨酸激酶抑制剂药物埃罗替尼联合吉西他滨可延长总生存期[36]，因此携带ctDNA的EGFR突变的胰腺癌患者可能受益于EGFR酪氨酸激酶抑制剂药物治疗。这些靶点和靶向药物的出现为胰腺癌患者的治疗带来了新的突破。
基于ctDNA的液体活检样本进行靶基因测序的分析可以指导选择抗肿瘤药物，进而探索精准个体化治疗方法。这意味着患者在治疗前可以通过对ctDNA的靶基因测序分析，根据个人情况选择合适的治疗方法，更有针对性与效率性。随着技术的提高、分析方法的改进和更多的药物靶点的发现，ctDNA可以成为定制个性化治疗的有力的辅助手段。
3 小 结
总体来说，ctDNA在胰腺癌中的临床应用进展非常迅速，但还需要更多更大规模的研究。尽管存在很多技术或生物学挑战，ctDNA仍然展现了其在早期诊断，评估预后与化疗效果以及指导选择抗肿瘤药物等方面的巨大潜力。相信随着技术的逐渐发展与研究的不断深入，ctDNA在胰腺癌的诊治领域将会发挥更大的作用。
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