细针穿刺活检（fine needle aspiration biopsy，FNAB）是指应用无菌穿刺针穿刺结节可疑部位并抽取部分结节成分送细胞学病理检测的一种鉴别甲状腺结节的方法，可减少不必要的手术和避免延误甲状腺癌的诊断及治疗。随着人们健康意识的增强及各种检查手段的不断完善，甲状腺结节的检出率也随之上升。甲状腺结节的诊断策略包括甲状腺彩超、超声造影、颈部薄层CT、甲状腺FNAB、基因检测等，FNAB是术前鉴别甲状腺结节性质的首选检查，有助于制定恰当的手术方案及明确手术范围。目前，FNAB在许多国家和地区的甲状腺肿瘤诊断和治疗中被作为甲类推荐。然而，由于我国FNAB技术开展较晚，目前尚未在临床普及，相关学科对FNAB在甲状腺结节在术前诊断的价值及重要性缺乏足够的认识，笔者就基于FNAB的分子检测技术在甲状腺结节诊断中的研究进展进行综述。
1 FNAB 的发展历史
甲状腺穿刺活检术最早始于1843年，我国于20世纪80年代引入FNAB技术，随着甲状腺结节的检出率逐渐升高，医患对于甲状腺结节诊疗水平的要求不断提高，FNAB逐渐受到国内学者的重视。1985年6月，曾宪九和贾振庚[1]对100例甲状腺结节行触诊下细针穿刺吸引检查并进行了临床报道，揭开了我国甲状腺结节FNAB技术的序幕。我国于2012年制定了《甲状腺结节和分化型甲状腺癌诊治指南》[2]以后，越来越多的学者开始关注甲状腺结节FNAB诊断技术。经过长达5年的探索与临床实践，经国内相关专家讨论，2018年公布了《超声引导下甲状腺结节细针穿刺活检专家共识及操作指南》[3]，加速了该项技术在我国的发展进程。
2 FNAB 的适应证
严格把握FNAB指征是避免甲状腺结节过度诊断的关键。各国甲状腺协会对于甲状腺结节FNAB指征仍无统一标准（表1）。目前，关于FNAB适应证的参考指征主要包括甲状腺结节可疑恶性超声征象及甲状腺癌的临床高危因素。
2.1 甲状腺结节可疑恶性超声征象
⑴低回声结节；⑵低回声伴结节微小钙化；⑶边缘不规则，向周围浸润；⑷结节中心血供丰富；⑸纵横比>1。
2.2 甲状腺癌的临床高危因素
⑴青少年时期接受过头颈部放射线照射或放射性物质接触史；⑵碘摄入异常；⑶分化型甲状腺癌、髓样癌家族史；⑷促甲状腺激素刺激；⑸血清降钙素水平异常升高。
2.3 FNAB 适应证的指南回顾
笔者总结了国内外广泛使用的指南（表1）。各国指南中对甲状腺结节的可疑声像特征虽然达成了一定的共识。但是，ATA指南中提出的结节纵横比（高>宽）在国内指南中并未明确指出。同时，2015版ATA指南降低了“低回声”这一可疑恶性超声征象的诊断权重[4]。此外，在对98%的甲状腺乳头状癌患者的多因素Logistic回归分析中，得出“结节内血供丰富”不是甲状腺癌发病的独立预测因子这一结论[5]。NCCN 指南与之观点一致。此外，ESMO指出单个可疑的恶性征象对恶性结节的预测价值很小，但当一个结节同时出现多个提示恶性肿瘤的超声征象时，超声检查的特异性有所增加，而敏感性则会显著降低[6-7]。因此，EMSO并没有根据结节是否为实性，结节的单一可疑恶性超声征象做更具体的要求。
表1 国内外指南的FNAB 标准
Table 1 Criteria of FNAB in domestic and global guidelines
指南国家综合癌症网 标准美国（NCCN）实性结节：具有超声可疑特征≥1 cm；没有超声可疑特征≥1.5 cm。囊实性混合结节：具有超声可疑特征：实性成分>1 cm；没有超声可疑特征：实性成分>1.5 cm。海绵状结节：≥2 cm。可疑颈部淋巴结：淋巴结FNAB±甲状腺结节FNAB。美国甲状腺协会（ATA）结节直径>1 cm 且超声表现为实性低回声；结节直径虽<1 cm 但具有恶性超声征象；结节直径>0.5 cm 且伴有高风险临床病史；任何大小的甲状腺结节，但超声显示颈部淋巴结转移征象；TSH 水平正常或升高的患者应结合超声检查，而对于血清TSH 降低的患者应结合甲状腺核素扫描与超声检查的结果共同判定；对于PET 意外发现的甲状腺肿瘤应密切结合超声检查结果决定是否需要进行US-FNAB。欧洲肿瘤内科学会（ESMO）任何>1 cm 的结节以及临床或超声怀疑恶性的结节<1 cm 均需行FNAB。中国抗癌协会甲状腺癌专业委员会（CATO） 凡结节直径≥1cm，均可考虑FNAB 检查。但在下述情况下，FNAB 不作为常规：⑴经甲状腺核素显像证实为有自主摄取功能的“热结节”；⑵超声提示为纯囊性的结节；⑶根据超声影像已高度怀疑为恶性的结节。结节直径<1 cm，不推荐常规行FNAB，但如果存在下述情况之一者，可考虑US-FNAB：⑴超声检查提示结节有恶性征象；⑵伴颈部淋巴结超声影像异常；⑶童年期有颈部放射线照射史或辐射污染接触史；⑷有甲状腺癌家族史或甲状腺癌综合征病史；⑸18F-FDGPET 显像阳性；⑹伴血清降钙素水平异常升高。
各国指南均建议术前常规测定甲状腺结节患者血清中的促甲状腺素（TSH）水平，因为血清TSH水平升高会引起甲状腺结节的恶性风险增加[8-9]。2015版ATA指南提出直径>1 cm的甲状腺结节应测量血清TSH水平。NCCN、ESMO、CATO指南与ATA指南均强调了血清TSH水平在甲状腺结节评估中的重要性。在一项纳入了126例患者的研究中发现血清TSH水平对PTMC进展的临界点为2.50 mU/L，血清TSH水平持续升高与PTMC进展相关[10]。此外，有研究[11]表明良性结节性病变血清TSH最低，PTMC次之，PTC最高。双侧肿瘤、包膜侵犯和淋巴结转移（LNM）患者血清TSH水平分别高于单侧肿瘤患者、无包膜侵犯患者和无LNM患者。侵袭性变异体PTC患者血清TSH高于非侵袭性PTC患者。研究[12]表明大多数甲状腺结节患者的血清TSH波动在参考范围内，但恶性结节患者的血清TSH浓度更可能处于正常上限，且血清TSH值>2.8 mU/L的患者患癌症的风险明显增加。Duccini等[13]探讨FNAB受试者血清TSH在参考范围内是否能预测甲状腺恶性肿瘤的研究中发现良性患者TSH平均浓度为（2.09±1.15）μL，DTC患者为（2.73±1.33）μL（P<0.01）。随着促甲状腺素从四分位数1增加到4分位数，恶性诊断的频率也从四分位数1的22%逐步增加到最后四分位数的65%（P<0.001）。Golbert等[14]发现，高TSH水平可能与甲状腺癌的患病风险增加有关。同时，王群等[15]也证实了高水平的TSH对于甲状腺癌的发生发展有一定的促进作用，这表明了术前测定血清TSH水平可以成为甲状腺癌的预测指标。
3 FNAB 的并发症
甲状腺细针穿刺活检属于有创性检查，不可避免地会有并发症发生。并发症的发生及严重程度与甲状腺结节的位置、穿刺针的直径、穿刺医师的操作经验有关。
FNAB最常见的并发症是局部疼痛和瘀斑，严重的并发症包括血肿（包括皮下血肿），气管或食管损伤和肿瘤种植转移等。与FNAB相关的疼痛数据很少。接受FNAB的患者中仅有8.9%报告有轻度疼痛[16]。穿刺后疼痛可通过局部冰敷缓解，也可选用药物止痛。甲状腺穿刺出血多由静脉渗血所引起。研究表明，甲状腺穿刺的出血率为0.3%～2.3%[5，17]。少量及中等量的出血无需干预，可自行恢复。大量出血则需要住院干预治疗。关于穿刺引起的肿瘤种植转移仅有极少数报道，Polyzos等[18]报道一项Meta分析，研究结果表明由FNAB所引起的肿瘤种植转移的发生率约为0.20%～1.85%%，其原因为均使用了23G以上的穿刺针。FNAB导致肿瘤种植转移发生率低的原因可能与穿刺针细、甲状腺癌恶性程度不高及使用TSH抑制治疗等有关。
4 基于FNAB 的诊断技术
4.1 巴氏染色
病理诊断是判定结节良恶性的金标准，其正确诊断的关键是有合格的标本和良好的制片及染色方法。巴氏染色作为最常用的染色方法之一，其在甲状腺穿刺样本的染色中的优势更为明显，它可以清楚地显示出甲状腺滤泡上皮细胞的核内结构[19]，具有细胞内结构分明、透明度佳等特点。对于甲状腺细胞学结果的解读，参照甲状腺结节病理学Bethesda报告系统诊断及分类标准[20]：I类：标本无法判断，未见足够细胞成分，无法作出诊断或不满意；II类：良性滤泡性结节；III类：意义不明确细胞非典型病变或滤泡性病变；IV类：可疑滤泡性肿瘤或滤泡性肿瘤；V类：可疑恶性肿瘤；VI类：恶性肿瘤，涂片细胞学形态呈恶性表现。值得一提的是巴氏染色配制过程较为繁琐，染色过程相对复杂等多因素影响细胞的着色效果，从而提高了涂片的诊断难度[21]。
4.2 液基细胞学检查
液基细胞学技术（thinprep cytologic test，TCT）最初在美国广泛应用于妇科宫颈脱落细胞诊断[22]。目前，TCT在甲状腺细针穿刺细胞学方面也取得了较好的效果。液基细胞学检查作为一种改良的细胞学检查方法，其细胞学特征明显优于传统涂片。首先，标本存放的保存液中含有冰醋酸，能有效清除标本中的红细胞，从而降低红细胞对标本的干扰[23]，相对于传统涂片进一步提高了FNAC诊断的阳性预测值（93.2%）及阴性预测值（82.9%）[24]。此外，TCT能重复制作多张涂片，方便进一步进行特殊染色，还可以行免疫组化及流式细胞学检测研究。但是TCT也有一定的局限性，比如穿刺标本获得的数量太少以及因甲状腺结节太小而没有穿到典型病变区域，都可能影响最终的诊断结果。
4.3 免疫细胞化学技术
随着病理技术的进一步发展，免疫化学技术在病理诊断中得到广泛运用，是肿瘤病理诊断重要的辅助检查。免疫细胞化学（immunocytochemistry，ICC）技术是对细针穿刺抽吸物进行检测[25]。在临床中广泛应用于肿瘤良恶性鉴别。随着肿瘤研究的进展，国内外文献相继报道了一些分子标记物如细胞角蛋白19（CK-19）、半乳糖凝集素（galectin-3）、高迁移率族蛋白1（HBME-1）、甲状腺转录因子1（TTF-1）和TPO等来辅助甲状腺结节定性诊断。目前，虽然发现了许多与PTC有关的分子标记物，但由于单个标记物的灵敏度和特异性不高，检测技术要求较高，成本昂贵等因素，因此它们在临床上的应用并不广泛。随着分子生物学的发展，多分子联合诊断可以改善单个分子标记物的缺陷，进一步帮助FNAB做出更加精准的诊断。
4.4 甲状腺肿瘤易感基因检测技术
随着分子遗传学的快速发展，越来越多的分子标记物被报道，如BRAF、RAS、RET/PTC、TERT 等。目前，临床指南推荐经FNAB 仍不能明确其性质的甲状腺结节，可对FNAB标本进行甲状腺肿瘤易感基因检测，这将有助于提高诊断的敏感度和特异度，从而有利于临床诊疗策略的制定。
4.4.1 BRAFV600E 基因突变 BRAFV600E 是甲状腺癌最常见的基因改变，BRAF 基因突变时MAPK/ERK 信号通路发生改变，从而引起肿瘤的发生及发展。目前BRAF 基因检测主要研究最常见的T1799A 突变（BRAFV600E），对确诊肿瘤的切片进行去石蜡化和DNA 提取，用PCR 扩增BRAF 基因的第15 外显子，通过测量FAM 信号的Ct 值来确定PCR 的效率[26]。Nikiforov 等[27]研究发现，当行FNAB 检查不能评估甲状腺结节性质时，在FNAB 基础上联合BRAFV600E 基因检测可显著提高PTC 诊断的准确性。此外，李晓锋等[28]研究表明，FNAB 细胞学诊断与BRAFV600E 基因突变联合检测甲状腺良恶性结节的敏感度、特异度分别为86.3%，100.0%，提示了BRAFV600E 突变联合细胞学检查在一定程度上提高了甲状腺恶性结节的检出率。Choi 等[29]发现在甲状腺癌中BRAFV600E 突变可导致一些摄碘基因(TSHR，NIS)的表达下降，进而引起引起碘化物积聚能力降低，导致PTC 患者对放射性131I 治疗不敏感，这表明BRAF 基因突变也可作为PTC 患者后续治疗和预后评价的重要工具之一。
4.4.2 RET/PTC 重排 原癌基因RET 编码受体酪氨酸激酶，从而影响RAS-MAPK 和PI3K-AKT级联反应的调节，参与细胞存活，分化和增殖。RET / PTC 是RET 酪氨酸激酶的3' 端与伴侣基因的5' 端之间进行基因重组的结果[30]。RET/PTC 重排后导致RAS-RAF-MAPK 通路异常激活，导致甲状腺细胞癌变[31]。RET/PTC 基因重排发生率为5%～35%[32]。Khan 等[33]研究结果表明RET/PTC3重排仅限于PTC，而且RET / PTC3 重排与TSH 水平升高和淋巴结转移等临床病理参数之间存在显著关联。而RET/PTC1 重排在微小乳头状癌多见，在PTC 的滤泡亚型中则比较少见[34]。一项荟萃分析[35]的结论表明RET / PTC 重组在甲状腺癌中具有较高的特异性（18%）和阳性预测值（87%）。术前对BRAF 和RAS 野生型不确定甲状腺结节的RET/PTC1 重排分析有助于制定明确的手术计划。在一项研究中，作者采用实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测RET/PTC1 重排分析细针抽吸（FNA）与福尔马林固定石蜡包埋标本（FFPE）RET/PTC1 重排的相关性。发现10 例FNA 与配对FFPE 甲状腺乳头状癌（PTC）RET/PTC1 重排结果完全相关。76 例BRAF 和RAS 野生型经典PTCs 中有29 例（38.2%）有RET/PTC1 重排[36]。综上，RET/PTC 重排检测有助于对甲状腺结节作出更加精准的诊断，可以作为FNAB 检查的重要辅助手段。
4.4.3 RAS 基因突变 继BRAF 突变之后，在甲状腺癌中第二个最常见的突变是RAS 原癌基因突变。RAS 基因通过MAPK 和PI3K-AKT 信号途径参与膜酪氨酸激酶受体到细胞核的信号传递，参与细胞生长和分化。当RAS 原癌基因的突变使其编码的蛋白质失去其固有的GTP 酶活性，导致甲状腺肿瘤发生。由于在良性及恶性甲状腺肿瘤中均可观察到RAS 基因突变，因此在对甲状腺结节进行RAS 基因检测结果提示为阳性时，不能完全判定该结节为恶性结节，但RAS 基因突变对甲状腺的诊断有一定的参考价值，这表明了RAS 癌基因突变可作为甲状腺肿瘤的一项筛查指标。最新的欧洲甲状腺协会指南指出，RAS 突变与更高的恶性肿瘤风险相关，但不应用于指导是否进行外科手术干预。近年发表的一项纳入208 例患者进行了FNAB 和突变检测研究发现只有10% 的恶性肿瘤是FTC，其最常见的基因突变是RAS 突变，剩下的90% 是PTC，已知其与RAS 的相关性很低。对于不确定其性质的结节（不包括良性结节）ddPCR检测RAS 突变可能具有预测价值。ddPCR 是检测甲状腺细针RAS 突变的一种新的超灵敏方法[37]。一项分析显示[38]，在FNAB 诊断不能确定的情况下，FNA 穿刺物RAS 基因突变对恶性肿瘤的灵敏度为34.3%，特异度为93.5%。但目前就术前是否行FNAB 联合RAS 基因检测诊断甲状腺癌尚有争议。
4.4.4 TERT 启动子突变 TERT 基因定位于5 号染色体，是维持端粒酶活性的重要物质。端粒酶能够填补染色体末端、保持细胞持续性分裂。TERT启动子突变后导致端粒酶活性增加，保护端粒重复序列免受侵蚀并维持端粒长度，诱导细胞持续分裂从而诱发癌变[39]。TERT 启动子突变位点主要发生在C228T 和C250T，对TERT 突变的检测方法主要基于Sanger 测序，通过对TERT 启动子区域的DNA 进行PCR 扩增，然后对扩增产物进行Sanger 测序，根据基因组DNA 测序结果分析两个热点的突变情况[40-41]。Tanaka 等[42]在研究中用直接DNA 测序分析159 例PTC 样本的TERT 启动子突变，发现TERT 启动子突变20 例（12.6%），并且在研究中证实了TERT 启动子突变与侵袭性临床病理特征之间的显著关联。Sayiner 等[43]对150 例甲状腺癌患者的TERT 进行分析研究表明，86% 的FTC 表现为阳性，PTC 的阳性率为46%，以上研究均表明了当病理结果不充分时，TERT 可以提高PTC 和FTC 之间的鉴别诊断。此外，Xing等[44]发现TERT 合并BRAF 基因突变时，患者的复发率明显增高，相比于单一的BRAF 基因判断预后具有更高的准确率。研究[45]表明，在TERT启动子突变的前提下同时干扰BRAF 信号转导可有效抑制癌症进展。这可能为治疗甲状腺癌开辟新的道路。
4.5 FNAB 洗脱液检测
为了提高FNAB的诊断准确率，20世纪末首次提出用细针穿刺淋巴结检测甲状腺球蛋白（LNFNA-Tg）浓度，以提高对淋巴结转移的诊断，其敏感性和特异性可达到近100%[46]。颈部淋巴结转移的危险因素包括年龄<45岁、多灶性肿瘤、侵出包膜等[47]，颈部淋巴结的检测是甲状腺癌诊治过程中的重要步骤[48]，LN-FNA-Tg和FNAC的结合可使诊断淋巴结转移敏感度和特异度几乎达100%[49]。Xu等[50]也证实了FNAC和FNA-Tg联合检测在DTC的淋巴结转移的诊断价值方面优于FNATg或FNAC。因此，通常建议将LN-FNA-Tg作为FNAC的常规测量方法以诊断淋巴结转移。甲状腺球蛋白（thyroglobulin，Tg）是诊断甲状腺癌特异性的肿瘤标志物，当甲状腺组织发生病变后甲状腺滤泡上皮细胞分泌Tg，Pacini等[46]研究发现，对于甲状腺癌伴有颈部淋巴结转移的患者可检测到较高浓度的Tg，因此通过测定LN-FNA-Tg含量对于评估PTC患者是否出现淋巴结转移具有指导意义[51]。目前LN-FNA-Tg检测方法是在FNAB操作结束完成涂片后用1mL生理盐水溶液冲洗针筒。将样品立即转移到临床实验室，采用自动免疫荧光法测定LN-FNA-Tg浓度，当FNA-Tg>1.0ng/mL时判读为阳性。在一项研究[52]中，FNAC诊断的敏感度、特异度、准确率分别为80.00%、100%、84.62%，而FNA-Tg诊断的敏感度、特异度、准确率分别为95.77%、90.48%、94.57%。综上所述，在甲状腺细针穿刺的基础上联合穿刺洗脱液Tg定量检测能作为术前判断颈部淋巴结是否转移的有力补充。
5 总结与展望
近年来甲状腺癌发病率不断上升，早发现、早诊断与甲状腺癌的治疗及预后息息相关，超声检查是术前诊断甲状腺癌最敏感、最经济的方法，但诊断效能较低，FNAB作为甲状腺结节诊断的新技术在近10年迅速发展。严格把握穿刺指征、获取满意穿刺标本和准确判读穿刺结果有助于FNAB质量控制措施的全面施行。随着分子生物学的进步，一些分子标记物，如BRAF、RET/PTC、RAS、TERT 等被用于甲状腺癌的辅助诊断，部分人建议使用它们来进行甲状腺结节的风险分层，从而建立更为完善的影像学-细胞病理-分子靶标多层次诊断体系，最大程度地提高术前诊断的精准性，指导治疗策略的制定，也为判断预后提供有力的依据。
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