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长链非编码RNA GAS8-AS1与微小RNA 135b在肝细胞癌中的表达及临床意义

  • 王昀
  • 郜茜 ✉
青海大学附属医院 消化内科，青海 西宁 810000

中图分类号： R735.7

最近更新：2023-02-03

DOI：10.7659/j.issn.1005-6947.2023.01.007

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摘要

背景和目的：大量研究表明，长链非编码RNA（lncRNA）与微小RNA（miRNA）及其靶基因之间内源性竞争的调控模式与恶性肿瘤的发生发展密切相关。笔者团队前期通过软件预测发现，lncRNA GAS8-AS1和miR-135b之间存在结合位点，但两者在肝细胞癌（HCC）中是否存在竞争关系及其作用尚不清楚。因此，本研究探讨lncRNA GAS8-AS1和miR-135b在HCC组织中的表达及其临床意义。

方法

收集2017年2月—2019年2月在青海大学附属医院行手术切除的110例HCC患者的癌组织及癌旁组织标本，通过qRT-PCR检测lncRNA GAS8-AS1和miR-135b的表达，分析两者与患者临床病理特征及预后的关系。

结果

lncRNA GAS8-AS1在HCC组织中的表达明显低于癌旁组织，而miR-135b在HCC组织中的表达明显高于癌旁组织（均P<0.05）。两者的表达水平均与HCC患者的Edmondson分期、TNM分期、分化程度及淋巴结转移情况有关（均P<0.05）。lncRNA GAS8-AS1低表达患者与miR-135b高表达患者的3年总生存率分别明显低于lncRNA GAS8-AS1高表达患者与miR-135b低表达患者（均P<0.05）。lncRNA GAS8-AS1低表达、miR-135b高表达以及高Edmondson分级、高TNM分期、有乙肝病史是影响HCC患者预后的独立危险因素（均P<0.05）。

结论

在HCC组织中lncRNA GAS8-AS1低表达，miR-135b高表达，两者表达水平的消长可能与HCC的发生发展以及患者的预后密切相关。

China Journal of General Surgery, 2023, 32(1):87-93.

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是恶性程度较高，预后较差的恶性肿瘤之一，目前肝切除术仍是患者的主要根治方法之一[

1-2]。尽管近几十年来HCC的治疗取得了广泛的进展，但由于其早期诊断率低，且患者往往合并肝功能不全，只有不足30%的患者有手术切除的机会[3-4]。因此，探索有效的预后评估和治疗靶点是十分必要的。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）已被证明在基因表达中起着关键的调节作用[

5-7]。已有证据[8-10]表明，多种lncRNA在HCC中失调，并作为癌基因或抑癌基因参与HCC细胞生长、凋亡、迁移和侵袭。GAS8反义RNA 1（lncRNA GAS8-AS1）位于GAS8的第二个内含子中，并且是以与GAS8相反的方向转录994 nt的lncRNA[11]。据报道[12-13]，它是一种新的肿瘤抑制因子，可以影响甲状腺乳头状癌和结直肠癌中的肿瘤细胞增殖。但目前为止，它在HCC中的作用受到的关注较少。

微小RNA（microRNA，miRNA）是小分子非编码RNA，参与靶基因的转录后调控[

14-15]。越来越多的证据[16-18]表明，异常表达的miRNA参与调节HCC的发生发展。已有研究[19]发现，miR-135b的过表达可促进HCC细胞的侵袭和转移。但目前为止，其与HCC患者临床相关的报道较少。本课题组在前期预实验中通过生物学软件Targetscan（http ://www.targetscan.org）预测发现，lncRNA GAS8-AS1和miR-135b之间存在结合位点。因此，本研究旨在探讨lncRNA GAS8-AS1和miR-135b在HCC组织中的表达及临床意义。

1 资料与方法

1.1 病历资料

收集2017年2月—2019年2月在青海大学附属医院进行手术切除的110例HCC患者的癌组织及癌旁组织样本（>3 cm处）。根据Edmondson病理分级：Ⅰ~Ⅱ级52例，Ⅲ~Ⅳ级58例；根据TNM分期：Ⅰ~Ⅱ期48例，Ⅲ~Ⅳ期62例。所有组织在采集后立刻进行速冻，之后置于-80 ℃的冰箱中保存。

1.2 纳入标准和排除标准

纳入标准：⑴ 患者术前均未进行放化疗、介入、射频消融术及免疫治疗；⑵ HE染色常规病理检查均为原发性HCC，且未合并其他恶性肿瘤；⑶ 经２名病理医师确认为HCC；⑷ 有完整的临床资料，术后有随访数据。排除标准：⑴ 肝转移癌；⑵ 合并心、肾等其他重要器官功能不全；⑶ 合并有自身免疫性疾病；⑷ 临床资料及术后随访数据缺失。

1.3 试剂与仪器

RNA提取和分离试剂盒（Ambion，美国）；反转录试剂盒（Takara，中国）；NanoDrop 2000超微量分光光度计（Thermo，美国）；荧光定量PCR检测系统（BioRad，美国）。

1.4 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实验

严格按操作说明书，用Trizol® 试剂提取HCC组织及癌旁组织的总RNA，并通过NanoDrop 2000测定RNA的质量和浓度。用反转录试剂盒（Takara，中国）进行反转录，反应体系为：cDNA产物2 μL，2×SYBR® Premix Ex Taq TM Ⅱ 8 μL，上下游引物各1 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，RNase⁃Free H2O 7.6 μL。反应条件为：95 ℃ 1 min、95 ℃ 10 s、58 ℃ 45 s、72 ℃ 30 s，共40个循环。lncRNA GAS8-AS1和miR-135b的表达水平以2-ΔΔCT表示。实验所用引物序列如表1所示。

表1  研究所用引物序列
Table 1  Sequence of primers used in the study
引物序列（5'-3'）
lncRNA GAS8-AS1 正向：CAA CGA GCA AAC AAG AAG GA
反向：TGA GCC AAA CAG ACC AGT CA
miR-135b 正向：GGT ATG GCT TTT CAT TCC T
反向：CAG TGC GTG TCG TGG AGT
U6 正向：CTT CAG CCG GCA CAG CT
反向：CGC TAA TTT GCG TTC AAA CG

1.5 随访

术后经门诊、电话及住院等方式对患者进行随访，随访截止时间为2022年2月，随访终点为随访时间终止或患者死亡。

1.6 统计学处理

本研究经SPSS 23.0软件对数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差（x¯±s）表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料用例数（百分率）[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验。生存分析用Kaplan-Meier法，Cox比例风险模型分析影响患者预后的危险因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结　果

2.1 一般资料

本研究中年龄>55岁的患者有61例（55.45%），≤55岁的患者有49例（44.55%）；男性患者63例（57.27%），女性患者47例（42.73%）；肿瘤直径>5 cm的患者60例（54.56%），≤5 cm的患者50例（45.44%）；有乙肝病史的患者65例（59.09%），无乙肝病史的患者45例（40.91%）；术前甲胎蛋白>20 ng/mL的患者57例（51.82%），≤20 ng/mL的患者53例（48.18%）（表2）。

表2  患者的一般资料[n（%）]
Table 2  The general data of patients [n (%)]
参数数值
年龄（岁）
>55 61（55.45）
≤55 49（44.55）
性别
男 63（57.27）
女 47（42.73）
肿瘤直径（cm）
>5 60（54.56）
≤5 50（45.44）
乙肝病史
是 65（59.09）
否 45（40.91）
术前甲胎蛋白（ng/mL）
>20 57（51.82）
≤20 53（48.18）

2.2 lncRNA GAS8-AS1和miR-135b在HCC组织及癌旁组织中的表达情况

与癌旁组织比较，HCC组织中lncRNA GAS8-AS1的表达水平明显降低（0.47±0.03 vs. 1.03±0.8，P<0.05）；而miR-135b在HCC组织中的表达水平明显高于癌旁组织（3.17±0.29 vs. 1.12±0.16，P<0.05）（图1）。

图1  HCC组织及癌旁组织中lncRNA GAS8-AS1和miR-135b的相对表达量比较

Figure 1  Comparison of the relative expression levels of lncRNA GAS8-AS1 and miR-135b in HCC and adjacent tissues

2.3 lncRNA GAS8-AS1和miR-135b表达水平与患者临床病理参数的关系

本研究根据lncRNA GAS8-AS1、miR-135b表达水平的均值，将患者分为高表达组和低表达组。结果发现，lncRNA GAS8-AS1高表达组中高Edmondson分期、高TNM分期、高分化的患者比例明显低于lncRNA GAS8-AS1低表达组（均P<0.05）；而miR-135b高表达组中高Edmondson分期、高TNM分期、高分化的患者比例明显高于miR-135b低表达组（均P<0.05）（表3）。

表3  lncRNA GAS8-AS1和miR-135b表达水平与HCC患者临床病理参数的关系[n（%）]
Table 3  Relations of the expression levels of lncRNA GAS8-AS1 and miR-135b with the clinicopathologic variables of HCC patients [n (%)]
临床病理参数nlncRNA GAS8-AS1miR-135b
高表达（n=50）低表达（n=60）P高表达（n=62）低表达（n=48）P
Edmondson分期
Ⅰ~Ⅱ期 52 35（70.00） 17（28.33） 0.000 21（33.87） 31（64.58） 0.002
Ⅲ~Ⅳ期 58 15（30.00） 43（71.67） 41（66.13） 17（35.42）
TNM分期
Ⅰ~Ⅱ期 48 29（58.00） 19（31.67） 0.009 15（24.19） 33（68.75） 0.000
Ⅲ~Ⅳ期 62 21（42.00） 41（68.33） 47（75.81） 15（31.25）
分化程度
高分化 62 36（72.00） 26（43.33） 0.006 28（45.16） 34（70.83） 0.003
低分化 48 14（28.00） 34（56.67） 34（54.84） 14（29.17）

2.4 lncRNA GAS8-AS1和miR-135b表达水平与患者生存的关系

lncRNA GAS8-AS1高表达组3年总生存率为70.00%（35例）；lncRNA GAS8-AS1低表达组3年总生存率为30.00%（15例）；miR-135b高表达组3年总生存率为32.26%（20例）；miR-135b高表达组3年总生存率为67.74%（42例）（图2）。

图2  lncRNA GAS8-AS1和miR-135b表达水平与HCC患者的生存的关系

Figure 2  Relations of the expression levels of lncRNA GAS8-AS1 and miR-135b with the survival of HCC patients

2.5 影响HCC患者预后的多因素Cox回归分析

多因素Cox回归分析结果发现，高Edmondson分级、高TNM分期、有乙肝病史、lncRNA GAS8-AS1低表达及miR-135b高表达均为影响患者预后的独立危险因素（均P<0.05）（表4）。

表4  影响HCC患者预后的多因素Cox回归分析
Table 4  Multivariate Cox regression analysis of factors for prognosis of HCC patients
变量HR95% CIP
Edmondson分期（Ⅲ~Ⅳ vs. Ⅰ~Ⅱ） 2.453 1.733~3.715 0.016
TNM分期（Ⅲ~Ⅳ vs. Ⅰ~Ⅱ） 2.3627 1.376~3.447 0.009
分化程度（低vs.高） 1.633 1.253~2.541 0.006
lncRNA GAS8-AS1表达（低vs.高） 3.411 2.247~4.124 0.001
miR-135b表达（高vs.低） 2.618 1.844~3.431 0.004

3 讨　论

肝癌是世界上第六大常见的恶性肿瘤，也是男性癌症患者死亡的第二大常见原因。HCC是其最主要的组织学亚型，占原发性肝癌的70%~85%。但目前为止，HCC患者的5年生存率很低，每年仍有超过75万例患者死亡[

20-21]。虽然之前的研究发现HCC中存在许多异常表达的蛋白质编码基因，但仍需要寻找能帮助早期诊断及风险评估的新型分子标志物。

多项研究[

22]已经证明，lncRNA与肿瘤的关系目前已成为癌症研究的热点之一。HCC中lncRNA TLR8-AS1可通过miR-34a抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭。lncRNA UCA1在HCC组织中异常上调，并与TNM分期、转移和术后生存率相关[23]。lncRNA PTENP1过表达载体可有效减缓肝癌小鼠体内肿瘤生长，抑制肿瘤内细胞增殖，诱导凋亡、自噬和抑制血管生成[24]。这些结果表明，lncRNA可能在HCC的发生和发展中发挥重要作用，具有很大的临床应用价值。

GAS8-AS1是一种新鉴定的lncRNA，对于甲状腺乳头状癌和HCC的发生可能起关键作用。在甲状腺乳头状癌中，lncRNA GAS8-AS1发生的突变被证明与肿瘤发生密切相关[

25]。在HCC发生过程中，lncRNA GAS8-AS1通过MLL1/WDR5调节GAS8表达，从而抑制疾病进展[26]。但目前为止，lncRNA GAS8-AS1与HCC相关的临床研究并未见报道。本研究在HCC组织中观察到lncRNA GAS8-AS1低表达，提示lncRNA GAS8-AS1的表达水平可能与HCC的发生密切相关，这与之前的研究结果相似。在此基础上，本研究将lncRNA GAS8-AS1的表达水平与HCC患者的临床病理特征相关联，发现lncRNA GAS8-AS1水平低的HCC患者3年总生存率往往比lncRNA GAS8-AS1水平高的患者低，且lncRNA GAS8-AS1低表达是HCC患不良预后的独立指标。上述结果说明，lncRNA GAS8-AS1是HCC患者的一种新的预后生物标志物。

lncRNA已被证明可通过竞争性结合miRNA来调节肿瘤的发生发展[

27-29]。Qin等[30]研究发现，lncRNA GAS8-AS1可通过竞争性结合miR-187-3p和miR-1343-3p，并分别上调ATG5和ATG7的表达，进而促进甲状腺乳头状癌细胞的自噬。本课题组在前期通过生物信息学软件Targetscan预测，发现lncRNA GAS8-AS1和miR-135b之间存在调控靶点。张彦兵等[19]发现，miR-135b可通过靶向Hippo信号通路相关基因促进HCC细胞的侵袭和转移。本研究发现，miR-135b水平高的患者3年总生存率比miR-135b水平低的患者低，且miR-135b高表达是不良预后的独立指标，这也从临床层面验证了张彦兵等[19]研究结果。上述结果同样说明，miR-135b可能是HCC的潜在预后预测因子。

综上，lncRNA GAS8-AS1在HCC组织中表达下调，而miR-135b在HCC组织中表达上调，两者间存在调控位点且均可作为HCC患者潜在的预后生物标志物。但目前为止，lncRNA GAS8-AS1和miR-135b在HCC中的作用机制尚不十分明确，今后需通过实验进一步证实。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突。

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