摘要
NF-κB的活化在多种恶性肿瘤的发生、发展中起了重要的作用。研究发现，趋化因子受体5（CCR5）、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）以及PTEN/PI3K通路相关蛋白均在恶性肿瘤中异常表达。因此，本研究探讨以上分子在结直肠癌细胞中的作用及相互关系。
分别用Western blot、CCK-8实验、Transwell法检测结直肠癌HT29和SW480细胞经Maraviroc（CCR5抑制剂）、MG132（TRAF6抑制剂）和NF-BAY（NF-κB抑制剂）处理后，各蛋白表达的变化，以及增殖、迁移、侵袭能力的变化。
在两种结直肠癌细胞中，抑制CCR5蛋白后，PI3K的表达降低，PTEN表达升高（均P<0.05），TRAF6和NF-κB表达无明显变化（均P>0.05）；抑制TRAF6蛋白后，PI3K和CCR5表达降低，PTEN表达升高（均P<0.05），NF-κB的表达无明显变化（均P>0.05）；抑制NF-κB表达后，CCR5、TRAF6和PI3K表达降低，PTEN表达升高（均P<0.05）。三种抑制剂均可明显降低两种结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力（均P<0.05）。
结直肠癌是全世界最常见的癌症之一，是癌症死亡的主要原
核因子κB（nuclear kappa B，NF-κB）异常激活是肠癌恶性肿瘤中最重要的病因之
近来研
兔抗人NF-κB单克隆抗体、兔抗人TRAF6单克隆抗体、兔抗人CCR5单克隆抗体、兔抗人PI3K单克隆抗体，兔抗人PTEN单克隆抗体以及羊抗兔二抗购自美国Abcam公司。CCK-8试剂盒购自MedChemExpress（cat: No. HY-K0301）公司，Transwell小室和Matrigel胶购自康宁公司。
人结直肠癌细胞系HT29和SW480在DMEM培养基中培养，添加10% FBS，在37 ℃，5% CO2培养箱中培养。分别利用Maraviroc（250 nmol/L）、MG-132（50 μmol/L）、NF-κB抑制剂NF-BAY（90 μmol/L）与HT29细胞孵育0、12、24、48 h，取对应细胞分析相应指标。利用Maraviroc（300 nmol/L）、MG-132（70 μmol/L）、NF-BAY（140 μmol/L）与SW480细胞孵育0、12、24、48 h，取对应细胞分析相应指标。
利用RIPA缓冲液获得全细胞蛋白提取物，EZQ蛋白定量试剂盒（Invitrogen）进行定量分析。使用预制Mini-PROTEAN TGX无染色凝胶（Bio-Rad）通过SDS-PAGE分离蛋白提取物，并使用Trans-Blot Turbo转移系统将蛋白印迹到聚偏二氟乙烯膜（PVDC）上。用含5%牛血清白蛋白或脱脂奶粉的TBS-T封闭膜，然后分别用兔单克隆抗NF-κB（1∶1 000）、TRAF6（1∶1 000）、CCR5（1∶1 000）、PI3K（1∶1 000）、PTEN（1∶1 000）孵育过夜。以兔单克隆抗β-actin（1∶1 000）作为上样对照。联合辣根过氧化物酶结合的羊抗兔IgG与增强化学发光系统、ChemiDoc MP 成像系统显示条带。分析各组细胞中蛋白表达水平。
CCK-8试验（Cell Count Kit-8 SAB biotech）用于细胞增殖检测。按照生产商的方案，将细胞以每孔1.0×1
用CCR5抑制剂（Maraviroc）处理HT29和SW480细胞0、12、24、48 h后，Western blot分别检测各组细胞中CCR5、PTEN、NF-κB、TRAF6和PI3K蛋白的表达变化。结果显示，在Maraviroc处理后，随时间延长，HT29和SW480细胞中CCR5和PI3K蛋白的表达呈逐渐降低趋势，而抑癌蛋白PTEN表达呈升高趋势（部分P<0.05），但NF-κB和TRAF6的表达无明显变化（均P>0.05）（
图1 CCR5抑制剂处理细胞后蛋白表达变化 1）与0 h比较，P<0.05
Figure 1 Changes in protein expressions after treatment of CCR5 inhibitor 1) P<0.05 vs. 0-h value
用TRAF6抑制剂（MG132）处理HT29细胞和SW480细胞0、12、24、48 h后，Western blot分析细胞中CCR5、PTEN、NF-κB、TRAF6和PI3K蛋白表达水平，结果显示，MG132处理后，随时间延长，HT29和SW480细胞中TRAF6、PI3K和CCR5表达基本呈逐渐降低趋势，而PTEN表达呈升高趋势（部分P<0.05），NF-κB表达无明显变化（均P>0.05）（
图2 TRAF6抑制剂处理细胞后蛋白表达变化 1）与0 h比较，P<0.05
Figure 2 Changes in protein expressions after treatment of TRAF6 inhibitor 1) P<0.05 vs. 0-h value
用NF-BAY处理HT29和SW480细胞0、12、24、48 h后，Western bolt分析细胞中CCR5、NF-κB、PTEN、TRAF6和PI3K蛋白的表达，结果显示，NF-BAY处理后，随时间延长，HT29和SW480细胞中CCR5、NF-κB、TRAF6、PI3K蛋白表达基本呈逐渐降低趋势，而PTEN表达呈上调趋势（部分P<0.05）（
图3 NF-κB抑制剂处理细胞后蛋白表达变化 1）与0 h比较，P<0.05
Figure 3 Changes in protein expressions after treatment of NF-κB inhibitor 1) P<0.05 vs. 0-h value
CCK-8分析不同抑制剂处理后，HT29和SW480细胞增长的变化，结果显示，与处理24 h比较，抑制剂处理48 h后HT29和SW480细胞增殖明显抑制（均P<0.05）（
图4 CCK-8分析细胞增殖
Figure 4 Proliferation analysis by CCK-8 assay
利用CCR5抑制剂（Maraviroc）、TRAF6抑制剂（MG132）以及NF-κB抑制剂（NF-BAY）处理HT29和SW480细胞，Transwell小室试验结果显示，与对照组比较，Maraviroc、MG132以及NF-BAY处理后HT29和SW480细胞迁移和侵袭能力均明显降低（均P<0.05）（
图5 Transwell分析细胞迁移和侵袭能力 1）与对照组比较，P<0.05
Figure 5 Determination of cell migration and invasion abilities by Transwell assay 1) P<0.05 vs. control group
结直肠癌是全世界最常见癌症之一，早期诊断识别可尽早手术治疗并改善患者预后，降低结直肠癌病死
本研究结果表明，Maraviroc抑制HT29和SW480细胞中CCR5蛋白后，显著降低PI3K的表达，不影响TRAF6和NF-κB的表达，促进PTEN的表达；利用MG132抑制细胞中TRAF6蛋白后，可显著降低PI3K和CCR5的表达，而不影响NF-κB的表达，促进PTEN表达；抑制NF-κB表达后，可显著降低CCR5、TRAF6和PI3K表达，并促进PTEN表达。抑制该信号通路中CCR5、TRAF6和NF-κB蛋白，可降低癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。综上，推测结直肠癌细胞中NF-κB通过调控TRAF6/CCR5/PI3K信号通路，最终调节PTEN的表达在结直肠癌进展中发挥作用。
NF-κB信号通路调控不同的蛋白及下游分子的在免疫、炎症、细胞生长、细胞存活和凋亡过程中发挥重要作用。研
研
Nishikawa
PI3K信号通路在结直肠癌发生和发展中起着重要作用，Muzny
本研究结果表明，抑制NF-κB、TRAF6以及CCR5都会降低结直肠癌细胞中PI3K的表达，并与细胞增殖、迁移和侵袭有关，因此，PI3K通路在结直肠癌进展中发挥关键作用。PTEN是PI3K/Akt通路中的一种抑制剂，PTEN的缺失可激活PI3K而导致长期的肿瘤生长，在20%~40%的转移性结直肠癌患者中发现PTEN表达缺
综上，本研究结果表明，结直肠癌细胞中存在NF-κB异常活化，后者可能通过上调TRAF6与CCR5的表达，抑制抑癌分子PTEN的活性，从而导致促癌分子PI3K及其通路的活性升高。
利益冲突
所有作者均声明不存在利益冲突。
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