摘要
目前，慢性皮肤溃疡仍是影响患者日常生活及心理负担的重要疾病，其组织内细胞及细胞外基质的异常可能破坏微环境内的平衡，从而阻碍正常的皮肤修复进程，导致溃疡迁延不愈。其发生发展机制及诊断标志物尚无相关研究。单细胞测序是近年来新发展的高通量测序方法，通过对单细胞分辨率下的基因测序，精准地揭示疾病的机制，在多种疾病中均有研究。本研究利用单细胞转录组测序（scRNA-Seq）技术检测慢性皮肤溃疡组织细胞异质性，以期阐明慢性溃疡难以愈合的潜在分子机制，并为临床治疗提供新思路。
scRNA-Seq分析揭示了慢性溃疡组织的显著免疫－代谢重塑特征：溃疡组织中B细胞、单核细胞及巨噬细胞数量较对照正常组织增加2.1~3.5倍，同时伴随胶原合成基因（COL1A1/COL3A1）的广泛激活与免疫调节因子（如颗粒酶家族GZMA/GZMB/H）的协同抑制。跨细胞亚群的功能网络分析显示，HIF-1信号介导的缺氧应答与PI3K/Akt通路异常形成正反馈环路，加剧炎症因子（CXCL3/8，TGFBI）的分泌失衡及线粒体氧化磷酸化代偿性上调。
慢性皮肤溃疡（chronic skin ulcer）是指在多种致病因素干扰下，治疗超过1个月仍创面愈合缓慢的一类常见临床疾病，包括血管性溃疡（动脉闭塞硬化、静脉曲张）、压力性溃疡、动静脉溃疡和糖尿病溃疡
随着高通量测序技术的发展，转录组测序（RNA-Seq）技术已被用于深入探究慢性创面愈合中的分子机
本研究纳入标准为病程超过4周的难愈性慢性溃疡患者，排除标准如下：合并糖尿病、肝肾功能障碍、自身免疫性疾病（如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎）、活动性感染或恶性肿瘤病史、既往食物或药物过敏史、近3个月内接受过免疫抑制剂、化疗药物或激素类药物治疗。所有患者均在中南大学湘雅三医院接受治疗。本研究相关的样本采集、运输及管理流程已通过中南大学湘雅三医院伦理委员会审批（项目编号：Fast I 20001）。由经验丰富的主治医师进行手术采样，切取溃疡部位的溃疡组织及距离溃疡边缘3 cm处的正常皮肤组织部分。部分溃疡组织送检病理，另一部分置于细胞保存液中，供后续单细胞测序使用。
仪器：GEXSCOP
进行单细胞测序前，需要将组织样本消化成单细胞悬液，冲洗并剪碎组织、加入0.25%胰酶-EDTA溶液在37 ℃下反应15 min、评价消化液中细胞悬浮状态、加入无角质细胞完全培养基终止消化、通过40 μm细胞滤网过滤、1 500 r/min离心5 min、使用红细胞裂解液裂解红细胞、洗涤重悬，并最后对细胞计
在细胞裂解后，对带有特异标签的细胞的mRNA进行捕获，逆转录合成cDNA，使用纯化磁珠纯化后，对合成的cDNA检测浓度及片段大小进行质控。使用大规模单细胞转录组试剂盒及PCR仪进行cDNA测序文库构建。在文库质控合格后，利用Illumina平台按照设定参数进行测序。使用SOAPnuke软件（v1.5.6）去除接头序列并过滤无法确定碱基占比>10%的低质量数据。运用UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection）进行降维分析，并通过SingleR对单细胞亚群进行注释。
使用Seurat软件包对细胞中的差异表达基因进行分析，P<0.05为显著差异，其中avg_log2FC表示基因倍数变化。对排名前十的显著上调和显著下调基因分别进行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析及Gene Ontology生物过程（GO_BP）富集分析。
共收集7份组织样本，其中5份来自溃疡组织（腿部3例：UL1、UL2、UL5；臀部2例：UH3、UH4），2份来自对照组皮肤（腿部CL6；臀部CH7）（
图1 来自溃疡组织的样本
Figure 1 Sample from ulcer tissue
图2 不同组织中各种细胞群的分布 A：采用不同颜色标记的UMAP图，显示鉴定出的9个不同细胞群的总体细胞分布；B-C：不同组织中细胞的UMAP图；D：各样本中不同细胞群所占比例
Figure 2 Distribution of various cell populations in different tissues A: UMAP plot with different color labels, showing the overall distribution of 9 identified cell populations; B-C: UMAP plots of cells from different tissue types; D: Proportions of different cell populations in each sample
在臀部与腿部溃疡组及对照组的B细胞、内皮细胞、角质形成细胞中，部分基因存在明显差异表达。B细胞中COL3A1、IGHG2等上调，EIF1AY、TRIM1等下调；内皮细胞中COL1A2、COL1A1等上调，ACTB、ITGA6等下调；角质形成细胞中MT-ND1、MT-ND4等上调，LGALS7、FABP5等下调。KEGG分析显示，这些差异基因富集于PI3K/Akt、RNA转运、细胞黏附及逆向神经信号传导等通路（
图3 溃疡组和对照组中B细胞、内皮细胞及角质形成细胞的基因及功能分析 A-F：臀部和腿部组中三种细胞的主要差异表达基因；G-L：臀部和腿部组中三种细胞的KEGG分析，展示了显著富集的项目
Figure 3 Gene and functional analysis of B cells, endothelial cells, and keratinocytes in the ulcer and control groups A-F: Major differentially expressed genes of the three cell types in the hip and leg groups; G-L: KEGG analysis of the three cell types in the hip and leg groups, showing significantly enriched pathways
溃疡组与对照组的单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞亦存在明显差异表达。单核细胞中CXCL8、CXCL3等下调，TMSB4X、RPLP1等上调；巨噬细胞中COL1A1、COL1A2等上调，TGFBI、CLEC5A等下调。中性粒细胞方面，HES1低表达，而HBA2、HBB等基因高表达。差异基因富集结果提示，这些细胞与HIF-1、趋化因子、破骨细胞分化等通路相关（
图4 溃疡组和对照组中巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞的基因和功能分析 A-F：臀部和腿部组中三种细胞的主要差异表达基因；G-L：KEGG分析，展示了显著富集的项目
Figure 4 Gene and functional analysis of macrophages, monocytes, and neutrophils in the ulcer and control groups A-F: Major differentially expressed genes of the three cell types in the hip and leg groups; G-L: KEGG analysis, showing significantly enriched pathways
在臀部与腿部溃疡组中，T细胞中HSPA1B、HSPD1等基因上调，MT-RNR1、MALAT1等下调；组织来源干细胞中IGHG4、IGHG3等上调，IL24、PSMA7等下调。与对照组比较，T细胞差异基因富集于细胞黏附分子、细胞内吞等通路；组织来源干细胞差异基因则在氧化磷酸化、PI3K/Akt等途径上表现突出（
图5 溃疡组和对照组中T细胞与组织来源干细胞的基因和功能分析 A-D：臀部和腿部组中两种细胞的主要差异表达基因；E-H：两种细胞的KEGG分析
Figure 5 Gene and functional analysis of T cells and tissue-derived stem cells in the ulcer and control groups A-D: Major differentially expressed genes of the two cell types in the hip and leg groups; E-H: KEGG analysis of the two cell types
对溃疡组与对照组中差异表达基因的GO_BP分析显示，不同细胞类型的高表达基因多富集于免疫应答、细胞质翻译、蛋白水解、氧化应激等过程；低表达基因则与血管生成、线粒体功能、细胞趋化及细胞因子调控等相关（
图6 GO_BP富集分析 A-B：上调基因；C-D：下调基因
Figure 6 GO_BP enrichment analysis A-B: Up-regulated genes; C-D: Down-regulated genes
本研究利用单细胞转录组测序技术，从多个细胞亚群和信号通路层面，对比分析了慢性皮肤溃疡与正常皮肤组织的差异。在整体结果中发现，尽管溃疡组和对照组都含有B细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞、角质形成细胞、内皮细胞等常见细胞类型，但慢性溃疡组织中的部分细胞亚群数量明显增多，且多条涉及炎症反应和免疫调控的通路失衡，提示慢性溃疡并非简单的组织缺损，而是一种由持续性炎症微环境主导的复杂病理过程，这与之前的研究一致，如Cui
颗粒酶基因（GZMA、GZMB、GZMH）在溃疡组织中的显著下调，表明此类分子对清除受感染细胞或病原体的作用可能被削弱。其中颗粒酶B（GZMB）早有报道其介导的细胞凋亡与晚期动脉粥样硬化推动的伤口不愈合相
从富集分析看，HIF-1、TNF、NLRs、MAPK等多条常见的免疫与血管生成相关通路在溃疡组织中出现明显的表达异常。理论上，在缺氧环境下应激增高的HIF-1若无法充分激活下游VEGF、EPO、GLUT1等基
在此过程中，MT2A与HSPA1A等基因的上调也值得关注。已有研究显示，MT2A与金属离子结合并具有抗氧化和解毒作用；当其表达量升高时，可降低线粒体膜电位，继而诱导细胞凋
需指出的是，本研究仍存在一定局限性。首先，样本量相对较小，且溃疡组与对照组的解剖部位（腿部与臀部）存在异质性，可能限制结果的普遍性。其次，尽管单细胞测序解析了细胞亚群差异，但未结合空间转录组或蛋白质组学验证关键分子的定位与功能，对机制推断的因果性支撑尚待加强。此外，患者个体间年龄、病程及合并症的差异可能影响细胞通信与基因表达模式，未来需扩大样本量并开展多中心队列研究，结合临床表型分层分析以增强结论可靠性。
综上所述，本研究依托单细胞测序，揭示了慢性皮肤溃疡中关键信号通路（如HIF-1、TNF、MAPK、PI3K/Akt）失调、免疫细胞功能紊乱（颗粒酶基因下调、巨噬细胞极化失衡）、代谢异常（线粒体功能障碍）及表观遗传改变（组蛋白修饰基因异常）等多层次病理特征。基于此，潜在治疗策略可聚焦于靶向干预核心通路（如HIF-1激活剂促进血管新生、TNF-α抑制剂减轻炎症）、重塑免疫微环境（调控巨噬细胞极化、恢复颗粒酶介导的凋亡功能）、修复代谢-表观遗传稳态（抗氧化剂、HDAC抑制剂）以及基于细胞异质性的个体化分型治疗（炎症型、血管障碍型、代谢衰竭型）。未来可针对颗粒酶基因、组蛋白修饰位点和线粒体稳态展开更深入的分子研究；也可通过多组学整合建立分子分型标准，结合工程化组织修复（干细胞-支架复合体）及智能递送系统（外泌体载药），推动从机制到临床的精准转化，为改善慢性溃疡愈合提供创新性解决方案。本研究为后续慢性溃疡的机理探索及个性化治疗策略提供了新的思路和理论依据。
作者贡献声明
王楚望、向艳莲、李珮婷负责论文撰写、数据分析、统计分析；王少华、陈佳、陈舒悦负责患者临床样本收集，熊武、刘钰负责实验研究思路构思、实验方法设计，周建大、符晓负责研究指导、经费支持、文章修改。
利益冲突
所有作者均声明不存在利益冲突。
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