摘要
Gasdermin（GSDM）家族由6个重要分子组成，主要负责调控细胞焦亡等多种生物学过程。近来不断有研究表明GSDM家族的表达失调参与多种癌症进程，然而GSDM家族成员在胃癌中的表达、预后、功能和潜在机制研究尚待阐明。本研究旨在通过生物信息学方法系统性的分析GSDM基因家族各成员在胃癌中的作用。
使用ONCOMINE、GEPIA2、UALCAN、Kaplan-Meier Plotter、cBioPortal、TIMER 2.0、DiseaseMeth等多个数据库对GSDM家族分子在胃癌患者中的表达差异、预后价值、功能富集、基因改变、免疫浸润相关性、甲基化改变等方面进行了综合分析。
GSDM家族中仅DFNA5在胃癌中明显高表达，表达水平较正常组织升高2.479倍。DFNA5在TNM 2、3、4期的表达明显升高，同时在肿瘤分级2、3级的表达明显升高。GSDM家族中仅DFNA5在胃癌中有预后价值，高表达的DFNA5提示较差的总生存期。GSDM家族中GSDMD的基因变异率最高（19%），GSDMA、GSDMB、GSDMC次之（14%），DFNA5（8%）和PJVK最低（6%）。在胃癌中筛选出186个GSDM相关的共表达基因，这些分子可能通过炎症细胞凋亡、趋化因子反应、急性炎症反应相关的信号通路参与胃癌进程。多数GSDM家族成员的表达与CD
关键词
Chinese Journal of General Surgery, 2021, 30(9):1068-1078.
胃癌是是全球最常见的消化道恶性肿瘤之
Gasdermin（GSDM）家族成员是近来鉴定的成孔效应蛋白。在人类中，GSDM家族内成员基于同源性鉴定共有6个，分别是GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、DFNA5（GSDME）和PJVK（DFNB59）。GSDM家族成员在晶体结构中共享一个高度类似的成孔结构域，该结构域是GSDM蛋白发挥功能的主要结构域，负责介导细胞膜透化和细胞焦
本研究从GSDM家族这一整体概念出发，通过多个生物信息平台数据库，系统分析了GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、DFNA5、PJVK这6个家族成员在胃癌中的表达差异、预后价值、基因变异情况、参与肿瘤进程的潜在功能及信号通路、与肿瘤免疫的相关性以及甲基化状态，旨在加深研究者对胃癌中GSDM基因家族的理解，为深入研究胃癌中GSDM家族各分子提供新的思路。
ONCOMINE作为肿瘤基因芯片数据库，可用于分析基因表达差异、寻找离群值、预测共表达基因
Kaplan-Meier plotter和GEPIA2数据库都可以用于评估某基因与常见癌症类型的预后关
cBioPortal是一个癌症基因组学数据库，包含常见癌症类型的基因组数据，并可供用户进行下载和分
WebGestalt全称为WEB-based Gene SeT AnaLysis Toolkit，是一个基于公共数据库的基因集分析工
TIMER 2.0是一个基于TCGA等公共数据库的综合分析平台，提供常见癌症中基因表达差异和免疫细胞浸润的相关性分
通过ONCOMINE和UALCAN数据库对GSDM基因家族在胃癌中的mRNA表达进行了分析。ONCOMINE数据库的分析结果显示：胃癌组织中DFNA5明显高表达，其表达水平较正常组织升高2.479倍（Cho Gastric数据集）；GSDMB的表达在胃癌组织中明显降低，较正常组织下降2.042~2.074倍（Chen Gastric数据集和DErrico Gastric数据集）；其余4个成员GSDMA、GSDMC、GSDMD和PJVK在胃癌中的表达较正常组织无差异（
图1 GSDM基因家族的mRNA表达情况 A：GSDM基因家族各成员在胃癌组织和正常组织中的mRNA表达（ONCOMINE）；B：GSDM基因家族各成员在胃癌组织和正常组织中的mRNA表达（UALCAN）；C：胃癌组织中各GSDM家族成员的相对表达水平（GEPIA2）
Figure 1 The mRNA expression levels of GSDM family members A: The mRNA expression levels of individual GSDM member in gastric cancer tissues and normal tissues (ONCOMINE); B: The mRNA expression levels of individual GSDM member in gastric cancer tissues and normal tissues (UALCAN); C: Relative mRNA expression levels of each GSDM member in gastric cancer tissues (GEPIA2)
接下来，利用UALCAN数据库探究GSDM家族的表达与临床TNM分期的相关性，结果显示：GSDMA、GSDMB、GSDMD、DFNA5的mRNA表达在多个TNM分期间存在明显差异（
图2 GSDM基因家族的表达与胃癌患者临床分期及肿瘤分级的关系（UALCAN） A：GSDM基因家族各成员与临床分期的关系；B：DFNA5的表达与肿瘤分级的关系
Figure 2 The relationship between the mRNA expression of GSDM family members and clinical cancer stage in patients with gastric cancer (UALCAN) A: The relationship between individual GSDM member and clinical cancer stage; B: The relationship between DFNA5 expression and tumor grade
本研究中，采用Kaplan-Meier plotter数据库评估GSDM家族在胃癌中的预后价值，分析结果显示：高表达GSDMC（P=0.028）和DFNA5（P=0.0013）的胃癌患者具有更差的总OS，而高表达GSDMD（P=0.007）的胃癌患者具有更好的OS（
图3 GSDM基因家族的表达与胃癌患者OS的相关性（Kaplan-Meier plotter）
Figure 3 The relationship between the mRNA expression of GSDM family members and OS in patients with gastric cancer (Kaplan-Meier plotter)
通过cBioPortal数据库分析胃癌患者数据集的基因改变状况（TCGA, Firehose Legacy，369例），结果显示：在369例胃癌患者中，共有167例（45%）患者存在GSDM家族基因改变，其中基因变异率GSDMD最高（19%），GSDMA、GSDMB、GSDMC次之（14%），DFNA5（8%）和PJVK最低（6%）（
图4 GSDM基因家族的基因改变及各成员之间的相关性 A：GSDM基因家族各成员的基因改变频率（cBioPortal；TCGA，Firehose Legacy）；B：GSDM家族各成员之间的相关性分析（GEPIA2）
Figure 4 The genetic alteration of individual GSDM family member and the correlation among its members A: The genetic alteration frequency of each GSDM member (cBioPortal; TCGA, Firehose Legacy); B: Correlation analysis among the GSDM family members (GEPIA2)
进一步探究GSDM基因家族相关共表达基因的作用，有助于更好地了解GSDM基因家族的功能。通过cBioPortal中的胃癌患者数据集（TCGA，Firehose Legacy）获得369例胃癌患者信息，并筛选出186个GSDM相关的共表达基因，并根据它们之间的共表达关系使用Cytoscape工具绘制成蛋白相互作用网络图发现：CXCL8、CXCL1、PF4、PPARG是GSDM基因家族功能最密切相关的主要分子（
图5 GSDM基因家族相关共表达基因的功能分析 A：蛋白相互作用图展示胃癌中与GSDM基因家族共表达的186个基因（cBioPortal，Cytoscape）；B：GO功能富集分析预测与GSDM基因家族共表达分子相关的生物过程、细胞成分、分子功能（WebGestalt）；C：KEGG通路富集分析GSDM基因家族共表达分子主要涉及的相关信号通路（WebGestalt）
Figure 5 Functional analysis of related co-expressed genes of GSDM family members A: The protein-protein interaction diagram showing 186 genes co-expressed with the GSDM family members in gastric cancer (cBioPortal, Cytoscape); B: GO functional enrichment analysis predicting the biological processes, cellular components and molecular functions related to the GSDM family co-expression molecules (WebGestalt); C: KEGG pathway enrichment analysis predicting the main signal pathways related to the GSDM family co-expression molecules (WebGestalt)
胃癌组织周围的免疫细胞浸润是重要的肿瘤微环境组成部分。本研究为了进一步探讨GSDM基因家族成员是否参与免疫相关调节机制，通过TIMER 2.0数据库分析GSDM基因家族各成员与CD
图6 通过TIMER 2.0数据库分析GSDM家族各成员GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、DFNA5、PJVK与CD
Figure 6 The relationship between individual GSDM member GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, DFNA5 and PJVK and the cell infiltration of CD
DNA甲基化是常见的癌症相关基因调控途径。本研究通过DiseaseMeth数据库分析胃癌中GSDM基因家族各成员的表达与其DNA甲基化水平的关系，结果显示：GSDMA、GSDMC、GSDMD在胃癌中的甲基化水平较正常胃组织中显著降低。结合前期研究结果：GSDMA、GSDMD的mRNA水平在胃癌中显著高表达（UALCAN），提示：GSDMA、GSDMD在胃癌组织中的异常高表达的调控机制可能与它们的低甲基化水平有关。DFNA5在胃癌组织中高表达，但其甲基化水平无明显改变（
图7 GSDM基因家族各成员在胃癌组织和正常胃组织中的DNA甲基化水平分析（DiseaseMeth）
Figure 7 DNA methylation levels of individual GSDM family members between gastric cancer tissues and normal tissues (DiseaseMeth)
焦亡作为一种促炎性程序性细胞死亡，主要由GSDM家族成员介导，发生过程中伴有多种炎症和免疫反
目前尚未有关于GSDM家族在胃癌中的整体系统性研究。本研究首先通过多个数据库探讨了GSDM家族成员在胃癌组织与正常胃组织中的表达差异。虽然GSDMA、GSDMB、GSDMD、DFNA5在单个数据库（UALCAN）中显示出表达的差异性，但仅有DFNA5的表达模式在多个数据库中具有一致性，即在胃癌组织中高表达，这表明DFNA5是较为合适的潜在的促癌基因，值得研究者进行深入探索。GSDM家族成员在Oncomine及UALCAN数据库中表达不一致的原因，一方面可能是因为UALCAN数据库主要收纳的是TCGA level 3级的RNA测序数据，而Oncomine数据库的数据来源主要为已经发表的癌症基因芯片数据；另一方面，当来自不同数据库的结果不一致时，提示可能有多重复杂的深层机制导致矛盾结果的产生，或者是样本量不足或者是高度异质性导致的偏倚。而其他GSDM基因家族成员在消除偏倚、细化胃癌研究对象标准后也可能具有重要的研究意义。
随后，生存分析结果显示：GSDMC和DFNA5高表达提示更差的患者预后，而GSDMD高表达提示更好的预后。同样，只有DFNA5在两个数据库中的生存分析结果是一致的，且其表达趋势与预后作用相符合，这进一步证明了DFNA5作为胃癌促癌基因的可能性。值得注意的是：DFNA5在某些其他类型肿瘤中被认为是肿瘤抑制基因。例如，在乳腺癌中，DFNA5通过介导肿瘤细胞的焦亡而发挥肿瘤抑制作
本研究筛选了胃癌中与GSDM基因家族功能相关的差异表达分子，并进行了功能和通路富集分析，以期望能促进研究者们对GSDM家族与胃癌之间关系的理解。GSDM基因家族相关分子主要涉及炎症细胞凋亡、趋化因子反应、急性炎症反应相关的信号通路，这与病原体衍生或宿主衍生的危险信号介导caspase切割GSDM家族蛋白，从而同时发挥焦亡及凋亡功能的理论相一致。GSDM基因家族可以通过触发细胞焦亡来抑制肿瘤生长，具体机制被认为与免疫相关，即细胞焦亡通过增强肿瘤相关巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，以及影响肿瘤浸润性CD
DNA甲基化是经典的表观遗传学修饰过程，在调节多种人类癌症相关基因的表达方面发挥关键作
本研究有以下几点局限性。首先，本研究用于分析的数据来自多个在线数据库，需要进一步的体内及体外来验证。此外，对单个GSDM成员在胃癌中的具体机制缺乏了解，后续的研究工作将通过具体实验进一步探究GSDM各成员在胃癌发生发展中的作用。
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