摘要
miR-200a-3p参与了多种肿瘤的生物学过程的调控，但在不同肿瘤中起着不同的作用（促癌基因或抑癌基因）。目前，其在胆囊癌中的作用尚不清楚。因此，本研究探讨miR-200a-3p在胆囊癌中的表达及其对胆囊癌细胞生物学功能的影响与机制。
采用qRT-PCR法测定32例胆囊癌及癌旁组织、胆囊癌细胞系（GBC-SD、SGC-996、NOZ）及正常人胆囊上皮细胞系HGBEC中miR-200a-3p的表达。采用Lipofectamine™ 3000试剂盒将GBC-SD及NOZ细胞系分别转染miR-200a-3p模拟物（miR-200a-3p过表达组）、miR-200a-3p抑制物序列（miR-200a-3p沉默组）及阴性对照序列（阴性对照组）。MTT实验测定细胞增殖能力，Transwell实验测定细胞侵袭能力，MiRBD/Targetscan7.2/starBase2.0/miRtarbase网站预测miR-200a-3p的下游靶基因，并采用荧光素酶实验验证。Western blot检测上述3组细胞中靶基因与上皮间质转化（EMT）相关分子蛋白（E-cadherin、vimentin）的表达。
qRT-PCR结果显示，胆囊癌组织中miR-200a-3p表达量低于癌旁组织，所有胆囊癌细胞系中miR-200a-3p表达量低于正常人胆囊上皮系HGBEC（均P<0.05）。GBC-SD及NOZ细胞系转染后，与各自的阴性对照组比较，两种细胞的miR-200a-3p过表达组miR-200a-3p表达量明显升高、增殖与侵袭能力明显减弱，两种细胞的miR-200a-3p沉默组miR-200a-3p表达量明显降低、增殖与侵袭能力明显增强（均P<0.05）。在线网站预测显示，miR-200a-3p和Notch2存在潜在结合位点；荧光素酶实验显示，miR-200a-3p导致Notch2野生型质粒pmirGLO-Notch2-3'UT WT荧光素酶活性明显降低，而miR-200a-3p对Notch2突变型质粒pmirGLO-Notch2-3'UTR MUT的荧光素酶活性没有影响。Western blot结果显示，两种细胞的miR-200a-3p过表达组与各自的阴性对照组比较，E-cadherin蛋白表达量升高、vimentin蛋白与Notch2蛋白表达量降低，而3种蛋白在两种细胞的miR-200a-3p沉默组则呈相反的变化（均P<0.05）。
胆囊癌是一种来源于胆囊上皮的恶性肿瘤，约占全部胆道肿瘤的80%~95
本研究纳入我院普外科于2016年1月—2020年12月收治并接受胆囊癌切除术的32例患者，其中男18例，女14例；平均年龄（58.9±5.0）岁。采集胆囊癌患者术后癌及癌旁组织并保存于-80 ℃冰箱待测。纳入标准：⑴ 通过病理和影像学诊断为胆囊癌的患者；⑵ 均接受胆囊癌切除术。排除标准：⑴ 存在其他部位的肿瘤患者；⑵ 临床检验资料不全者。本研究经我院伦理委员会批准并符合赫尔辛基宣言。
胆囊癌细胞系GBC-SD、SGC-996、NOZ，及正常人胆囊上皮细胞系HGBEC由华中科技大学同济医学院附属协和医院肝胆胰外科实验室赠予。Notch2、上皮间质转化（EMT）相关分子（E-cadherin、vimentin）、GAPDH一抗和HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗购自美国Abcam公司。RIPA试剂盒、BCA蛋白试剂盒、ECL试剂盒、胰蛋白酶和Lipofectamine™ 3000转染试剂购自美国Thermo Scientific公司。TransScript II Green两步法qRT-PCR SuperMix（AQ301-01）和TransScript Green miRNA两步法qRT-PCR SuperMix（AQ202-01）试剂盒购自广州锐博生物公司。MTT细胞增殖检测试剂盒购自上海碧云天生物技术公司。Transwell试剂盒购自美国Gibco公司。RT-PCR仪购自美国BD公司。上海吉玛公司负责miR-200a-3p模拟物序列、miR-200a-3p抑制物序列及阴性对照序列的设计和合成。
胆囊癌细胞系（GBC-SD、SGC-996、NOZ）及正常人胆囊上皮系HGBEC在含有10%FBS、青霉素-链霉素DMEM培养基中培养，在37 ℃和5%CO2的加湿培养箱中培养。细胞转染采用Lipofectamine™ 3000试剂盒，对GBC-SD及NOZ细胞系按试剂盒说明书转染miR-200a-3p模拟物（miR-200a-3p过表达组）、miR-200a-3p抑制物（miR-200a-3p沉默组）、阴性对照序列（阴性对照组），转染成功后行后续实验。
使用TRIzol试剂盒提取细胞系、癌和癌旁组织中的总RNA，通过紫外分光光度计测定其浓度和纯度，然后按照试剂盒指导进行逆转录。反应条件：95 °C 15 min；95 °C 15 s；58 °C 30 s；72 °C 15 min，共35个循环。每个标本设3个复孔，每个标本测定3次，以U6作为miR-200a-3p内参。使用
采用MTT实验测定细胞增殖能力，将转染24 h的3组细胞以4×1
将转染24 h的3组细胞以 5×1
收集各组培养细胞，RIPA裂解提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。总蛋白通过12%SDS-PAGE分离，转膜至PVDF膜上。加入Notch2（1∶300）、E-cadherin（1∶200）、vimentin（1∶300）及GAPDH（1∶500）一抗并在4 ℃下孵育过夜，漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（1∶500）在室温下孵育1 h。ECL化学发光试剂盒用于检测目标蛋白条带，扫描条带灰度，通过Quantity One计算其灰度值。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值。
MiRBD/Targetscan7.2/starBase2.0/miRtarbase网站用于预测miR-200a-3p的下游靶基因。采用荧光素酶实验验证miR-200a-3p的靶基因，使用Lipofectamine™ 3000试剂盒将miR-200a-3p模拟物分别与PmirGLO-Notch2-3'UTR野生型质粒（WT）、pmirGLO-Notch2-3'UTR突变型质粒（MUT）共转移到HEK293T细胞中。荧光素酶活性用萤火虫荧光素酶活性检测试剂盒进行检测。
胆囊癌组织中miR-200a-3p表达量低于癌旁组织[（1.63±0.65）vs.（4.38±1.13），P<0.05]（
图1 qRT-PCR检测miR-200a-3p的表达 A：miR-200a-3p在胆囊癌组织与癌旁组织中的表达；B：miR-200a-3p在胆囊癌细胞系与胆囊上皮细胞系中的表达
Figure 1 Expression of miR-200a-3p determined by qRT-PCR A: Expressions of miR-200a-3p in gallbladder cancer and adjacent tissues; B: Expressions of miR-200a-3p in gallbladder cancer cell lines and normal human gallbladder epithelial cell line
GBC-SD及NOZ细胞系经转染miR-200a-3p模拟物及抑制物序列后，行qRT-PCR检测，结果显示，两种细胞的miR-200a-3p过表达组miR-200a-3p表达量均高于各自的阴性对照组（均P<0.05），两种细胞的miR-200a-3p沉默组miR-200a-3p表达量均低于各自的阴性对照组（均P<0.05），提示转染成功，可行下步实验（
图2 qRT-PCR检测转染效率
Figure 2 Determination of transfection efficiency by qRT-PCR
MTT实验显示，转染24 h后，两种细胞各组的A490 nm值差异无统计学意义（均P>0.05），转染48、72及96 h后，两种细胞的miR-200a-3p过表达组A490 nm值均明显低于各自的阴性对照组（均P<0.05），两种细胞的miR-200a-3p沉默组A490 nm值均明显高于各自的阴性对照组（均P<0.05）（
图3 miR-200a-3p对胆囊癌细胞增殖的影响
Figure 3 Influence of miR-200a-3p on proliferation of gallbladder cancer cells
GBC-SD及NOZ细胞系经转染miR-200a-3p模拟物及抑制物序列后，Transwell实验显示，两种细胞的miR-200a-3p过表达组侵袭细胞数均少于各自的阴性对照组（均P<0.05），两种细胞的miR-200a-3p沉默组侵袭细胞数均多于各自的阴性对照组（均P<0.05）（
图4 miR-200a-3p对胆囊癌细胞侵袭能力的影响
Figure 4 Influence of miR-200a-3p on invasion abilities of gallbladder cancer cells
在线预测网站（Targetscan 7.2/starBase 2.0/miRBD/miRtarbase）检索分析显示miR-200a-3p和Notch2存在潜在结合位点（
图5 miR-200a-3p的靶基因预测 A：在线网站预测miR-200a-3p与Notch2存在靶向结合位点；B：荧光素酶实验验证Notch2为miR-200a-3p的靶基因
Figure 5 Prediction of target genes of miR-200a-3p A: Binding sites between miR-200a-3p Notch2 predicted by online website analysis; B: Luciferase assay verification showing Notch2 is the target gene of miR-200a-3p
GBC-SD及NOZ细胞系经转染miR-200a-3p模拟物及miR-200a-3p抑制物序列后，两种细胞的miR-200a-3p过表达组E-cadherin蛋白表达量高于各自的阴性对照组、vimentin蛋白表达量低于各自的阴性对照组、Notch2蛋白表达量低各自的于阴性对照组（均P<0.05）。两种细胞的miR-200a-3p沉默组E-cadherin蛋白表达量低于各自的阴性对照组、vimentin蛋白表达量高于各自的阴性对照组、Notch2蛋白表达量高于各自的阴性对照组（均P<0.05）（
图6 miR-200a-3p的表达对Notch2及EMT相关分子蛋白表达的影响
Figure 6 Effects of miR-200a-3p on the expressions of Notch2 protein and EMT-associaed molecules
胆囊癌患者病死率高的原因主要在于其起病隐匿，无明显早期临床特征，易于忽视；已诊断的胆囊癌常处于晚期，不适合手术，放化疗效果差；胆囊癌患者缺乏有效的筛查手
miRNA是不具有编码蛋白质功能的短链RNA，其主要功能是与靶基因mRNA的3'-UTR末端结合而调控下游靶基因的转录，起到抑制或降解靶基因的作
EMT是指上皮细胞失去原有极性，从而获得抗凋亡和较强的迁移及侵袭能力，进而转化为间质细胞的过程，在上皮源性肿瘤中发挥重要作
Notch2是一种编码跨膜蛋白的基因，作为膜结合配体的受体并与相邻细胞发生相互作
由于本研究是在体外细胞系中的初步研究，尚存在一定不足之处，比如：上调miR-200a-3p同时上调Notch2对癌细胞表型及下游分子改变的影响，miR-200a-3p表达与胆囊癌患者术后预后的关系等，都值得进一步研究。
综上，miR-200a-3p可抑制胆囊癌细胞增殖和侵袭过程，发挥抑癌基因功能，机制可能与下调Notch2及抑制EMT过程有关。
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