摘要
结直肠癌（CRC）是全球第四大常见癌症，血管生成异常是其进展的关键因素。柴胡皂苷D（SSD）作为中药柴胡的活性成分，具有潜在抗肿瘤作用，且其部分作用可能与血管生成有关。本研究探讨SSD对CRC细胞在裸鼠体内生长的影响，及其与血管生成相关VEGF/ERK/HIF-1α信号通路的关系。
于雄性Balb/c裸鼠背部皮下接种人CRC SW480细胞以建立荷瘤裸鼠模型，并随机分为模型组（生理盐水）及低、中、高3个剂量（5、10、20 mg/kg/d）SSD治疗组，每组各8只，腹腔注射给药，连续15 d。记录肿瘤体积并绘制生长曲线；剥离瘤体，称重并计算抑瘤率；HE染色观察肿瘤组织病理学变化；用CD31免疫组化定量肿瘤微血管密度（MVD）；qRT-PCR检测肿瘤组织中血管内皮生长因子A（VEGFA）、血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）mRNA表达水平；Western blot法检测肿瘤组织中VEGFA、VEGFR-2、缺氧诱导因子1α（HIF-1α）、细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）、p-ERK1/2表达水平。
与模型组比较，SSD呈剂量依赖性抑制肿瘤生长（均P<0.05），高剂量组抑瘤率达62.15%；HE染色显示，模型组移植瘤组织细胞密度大，排列无序，大小形态不规则，核异型性明显，SSD给药后移植瘤组织见有散在坏死灶，细胞密度减小，细胞核固缩、裂解；与模型组比较，3个剂量SSD治疗组肿瘤组织中MVD、VEGFA、VEGFR-2 mRNA与蛋白相对表达量，以及HIF-1α和p-ERK1/2蛋白相对表达量均降低，且均呈明显的剂量依赖性（均P<0.05）。
结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球第四大常见癌症，近年来其发病率呈上升趋势，随着诊断和治疗策略的改进，CRC患者生存时间显著增加，但病死率仍居高不
人CRC SW480细胞购自ATCC细胞库。7周龄雄性Balb/c裸鼠32只，体质量（22±2）g，由四川省人民医院实验动物研究所提供[SCXK（川）2018-15]。（24±2）℃、相对湿度50%~60%环境下普通饲养，给予充足水和饲料，12 h光/暗交替，适应性饲养1周。本研究遵循实验动物人道主义和“替代-减少-改善”原则。
SSD（DC0008，分子式：C42H68O13）购自成都德思特生物技术有限公司；血小板-内皮细胞黏附分子（Platelet endothelial cell adhesion molecule，CD31）（AF1642）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）（AF0312）购自上海碧云天生物技术有限公司；血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2）（ab11939）、HIF-1α（ab216842）、ERK1/2（ab184699）抗体购自美国Abcam公司；p-ERK1/2（bs-3016R）购自北京博奥森生物科技有限公司；CD31抗体、VEGFA购自上海碧云天生物技术有限公司；E0987型组织包埋机购自上海碧云天生物技术有限公司；HY-1508石蜡切片机购自德国QIAGEN公司；BX53M型光学显微镜购自日本OLYMPUS公司；ABI 7300型实时荧光定量PCR系统购自美国ABI公司；AU5800全自动生化分析仪购自美国贝克曼公司；Gel Doc XR+凝胶成像分析系统购自美国Bio-Rad公司。
SW480细胞在补充有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基（额外补充100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素）中，于37 ℃、体积分数为5% CO2的加湿培养箱内培养，期间胰蛋白酶消化传代。
取对数生长期SW480细胞，磷酸盐缓冲溶液调整细胞密度为2×1
取部分肿瘤组织保存于4%多聚甲醛固定过夜，常规石蜡包埋，并制备5 μm厚度组织切片，苏木精染色3 min，1%盐酸酒精分化15 s，0.6%氨水返蓝，流水冲洗后滴加适量伊红染液染色2 min，流水冲洗，脱水、透明，晾干后中性树胶封片，镜下观察肿瘤病理组织学变化并采集图片。
取石蜡组织切片，加热进行抗原修复，3% H2O2封闭内源性过氧化氢物酶活性，5%山羊血清37 ℃封闭后将切片与抗CD31抗体（1∶200稀释）4 ℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液洗涤，辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1 000稀释）37 ℃孵育30 min，磷酸盐缓冲液洗涤，DAB显色，苏木精复染，脱水、封片。通过对具有最高血管密度的5个区域中的任何CD31阳性染色的内皮细胞或内皮细胞簇进行计数来评估微血管，每个视野的平均微血管数被认为是微血管密度（microvessel density，MVD）水
使用TRIzol试剂分离移植瘤组织总RNA，利用逆转录试剂盒合成cDNA，后制备RT-qPCR反应体系，于实时荧光定量PCR仪内进行定量检测，热循环条件：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 40个循环；以GAPDH为内参基因，
移植瘤生长曲线显示，与模型组比较，3个剂量SSD治疗组移植瘤体积均减小，且呈剂量依赖性（均P<0.05）（
图1 SSD对CRC荷瘤裸鼠肿瘤体积的影响
| 组别 | 瘤重（g） | 抑瘤率（%） |
|---|---|---|
| 模型组 | 4.65±0.16 | — |
| SSD低剂量组 |
3.38±0.1 | 27.31 |
| SSD中剂量组 |
2.19±0.1 | 52.90 |
| SSD高剂量组 |
1.76±0.1 | 62.15 |
注： 1）与模型组比较，P<0.05；2）与SSD低剂量组比较，P<0.05；3）与SSD中剂量组比较，P<0.05
HE染色结果显示，模型组移植瘤组织细胞密度较大，排列无序，大小、形态均不规则，核异型性明显；低剂量SSD治疗组移植瘤组织结构紊乱，细胞密度减小，细胞核固缩、裂解；中、高剂量SSD治疗组均见组织内散在坏死灶，细胞较小（
图2 各组移植瘤组织HE染色（×200）
与模型组比较，3个剂量SSD治疗组肿瘤组织中MVD均明显降低，且呈明显剂量依赖性（均P<0.05）（
图3 各组移植瘤组织CD31免疫组化（×200）
| 组别 | MVD |
|---|---|
| 模型组 | 53.00±5.66 |
| SSD低剂量组 |
43.25±5.2 |
| SSD中剂量组 |
28.13±4.2 |
| SSD高剂量组 |
11.88±2.3 |
注： 1）与模型组比较，P<0.05；2）与SSD低剂量组比较，P<0.05；3）与SSD中剂量组比较，P<0.05
与模型组比较，3个剂量SSD治疗组肿瘤组织中VEGFA、VEGFR-2 mRNA相对表达量均明显降低，且呈剂量依赖性（均P<0.05）（
图4 qRT-PCR检测各组移植瘤组织中VEGFA、VEGFR-2 mRNA表达
组间ERK1/2蛋白相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）；与模型组比较，SSD低、中、高剂量组CRC荷瘤裸鼠肿瘤组织中VEGFA、VEGFR-2、HIF-1α和p-ERK1/2蛋白相对表达量均降低，且呈明显剂量依赖性（均P<0.05）（
图5 Western blot检测各组移植瘤组织中血管生成通路蛋白表达
血管生成是内皮细胞从预先存在的脉管系统中萌芽而形成新血管的过程，新血管的形成可为肿瘤提供营养和氧气，从而促进癌细胞的快速增殖和转移，为肿瘤进展的关键步骤之
本研究发现SSD治疗能显著减少CRC荷瘤裸鼠的肿瘤体积和肿瘤重量，且其抑瘤作用呈剂量依赖性。尤其是在高剂量SSD组，肿瘤体积和重量的减小最为明显，抑瘤率达到62.15%。这表明SSD在一定剂量范围内对CRC具有明显的抗肿瘤效应，可能通过促进肿瘤细胞凋亡或抑制肿瘤细胞增殖、迁移等机制发挥作
HE染色结果显示，SSD组肿瘤组织中细胞密度减小，细胞排列变得紊乱，且高剂量组出现明显的肿瘤坏死区域，这提示SSD可能通过破坏肿瘤微环境、促进肿瘤细胞死亡来抑制肿瘤生
肿瘤的血管生成是肿瘤生长、转移及耐药的重要因素之
在本研究中，SSD能够显著降低CRC荷瘤裸鼠肿瘤组织中VEGF、VEGFR-2、HIF-1α和p-ERK1/2的表达，且其表达量与SSD剂量呈负向关系。这表明SSD可能通过抑制VEGF/VEGFR-2信号通路、HIF-1α和ERK通路的激活，减少肿瘤组织中的血管生成和促肿瘤因子的释放，从而抑制肿瘤的生长和转
综上所述，SSD能够通过抑制VEGF/VEGFR-2、HIF-1α和ERK信号通路，抑制肿瘤生长和血管生成，对CRC的治疗具有潜在的应用价值。尽管本研究证实了SSD对CRC荷瘤裸鼠的抑瘤作用，但仍存在以下局限性：首先是样本量较小，可能影响统计效力，未来增加样本量以提高结果的可靠性。其次是缺乏体外实验验证，目前结果仅表明SSD与VEGF/ERK/HIF-1α通路的相关性，但未能阐明其具体调控机制，后续可通过细胞实验补充。最后是未探讨SSD的长期毒性和耐药性，SSD的临床应用需进一步评估其安全性及是否可能诱导肿瘤耐药。
作者贡献声明
李寅负责酝酿和设计实验，实施研究，采集数据、分析/解释数据起草文章；张婷负责实施研究，采集数据；王静负责统计分析，指导支持性贡献。
利益冲突
所有作者均声明不存在利益冲突。
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