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乳腺癌循环肿瘤细胞微流控芯片检测研究进展

  • 尉卓凡 1
  • 宁智文 2
  • 胡波 2
  • 袁时芳 1
1. 中国人民解放军空军军医大学第一附属医院 甲乳血管外科,陕西 西安710032; 2. 西安电子科技大学 生命科学技术学院,陕西 西安710126

中图分类号: R737.9

最近更新:2023-12-14

DOI:10.7659/j.issn.1005-6947.2023.11.020

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摘要

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。不可预测的转移性复发是乳腺癌患者治疗失败、复发乃至死亡的主要原因。循环肿瘤细胞(CTC)被定义为从原发肿瘤处脱落并进入循环或淋巴系统的肿瘤细胞。研究证实,CTC的检测可以为乳腺癌的诊断、治疗策略的制定和预后评估提供重要的临床信息。作为液体活检的重要检测对象之一,CTC能够简单地通过抽取患者的血液来收集。然而,大多数CTC在循环中死亡,只有极少数存活并侵犯远处器官。数量上的稀缺、CTC的异质性以及血液中复杂成分的干扰使得CTC的准确检测成为一个巨大的挑战。针对CTC的生物和物理特性开发的各种检测方法往往需要在检测前对CTC进行分离和富集,但吸附、洗脱和转移等预处理过程不可避免地会造成CTC的损失,而耗时、操作复杂、设备昂贵等问题也限制了CTC的临床应用,因此迫切需要开发新的检测技术。以微加工结构为特征的微流控技术近年来受到了广泛关注与研究,微流控技术可以精确控制微米级的流体和细胞,因而成为一种特别适合检测稀有CTC的方法。微流控芯片具有成本低、操作简单、低耗材、高通量、实时检测等优势,其小型化的特点可将多种检测技术集成于微尺度中,为CTC的分离、鉴定和表征提供了一个高效的平台,有助于对肿瘤患者进行个体化分析与治疗。最近,三维(3D)打印技术的兴起为微流控芯片的制造提供了更高效、个性化的方式,避免了传统微流体器件制作方法步骤复杂、耗时等问题。逐层打印出的3D结构将促进微流控芯片实现更高效率和更高通量,并将推动实验室技术成功应用于临床,为肿瘤的生物学和临床研究开辟新视野,为乳腺癌的诊断治疗提供前所未有的机会。本文中,笔者分析了近年来CTC的不同检测手段的特点,阐述了微流控技术在乳腺癌CTC检测中的应用研究,以及3D打印微流控芯片技术前沿,并对3D打印微流控芯片技术在乳腺癌CTC检测中的应用前景进行了展望。

在世界范围内,乳腺癌已成为最常见的肿瘤,是女性癌症患者死亡的主要原[

1],通过生物标志物早期识别其转移和复发情况至关重要。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTC)最早由Ashworth发现,其数量和生物学特征等包含着癌症进展和治疗反应的关键信息,被认为是转移性乳腺癌(metastatic breast cancer,MBC)的独立预后因素之[2]。CTC的检测为研究癌症转移提供了一种无创方法。作为CTC临床应用研究最广泛的肿瘤之一,已经开发了各种针对乳腺癌CTC的检测方法。然而,传统检测方法大多无法实现标准化的检测过[3],不完整不准确的检测结果限制了CTC在临床中的应用。与之相比,微流控芯片为CTC的全面研究带来了可[4],凭借在特异度、敏感度、通量、效率上的优势,微流控芯片具有将CTC实时检测应用于临床的巨大潜力。其中三维(3D)打印技术可实现标准化的微流控芯片制造,从而获取更多关于肿瘤有价值的信息,推动CTC从指导肿瘤预后到预测肿瘤进展,为乳腺癌的精准治疗提供前所未有的机会。本文对基于不同原理的CTC检测方法进行总结,着重分析了乳腺癌CTC的微流控检测研究现状及进展,对3D打印微流控芯片的广阔应用前景进行了展望。

1 常见的CTC检测方法与存在问题

外周血中的CTC浓度非常低,大多数癌症患者每毫升血液中仅1~10个CTC[

5],因此需要高敏感度和高特异度的技术来检测。根据CTC区别于血细胞的独特性质,常见的检测方法大致可分为两类,即基于生物特性和基于物理特性的方法。

1.1 基于生物特性的方法

基于CTC的生物学特征,通常利用附着在磁性物质表面的细胞表面标志物抗体等来筛选CTC。

阳性富集通过靶向CTC表面的特异性抗原来实现,通常可实现高纯度富集。CellSearch系统使用涂有上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)抗体的铁磁颗粒,对CTC进行免疫磁分离并计[

6],Cristofanilli[7]检测了177例MBC患者的血液样本后得到结论:每7.5 mL血液中CTC≥5个的患者,其无进展生存期(progression free survival,PFS)和总体生存期(overall survival,OS)更短。然而该方法易造成假阴性率高,现已停止生产和临床应用。另外,CTC经上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程后会导致EpCAM的下调或丢[8],从而逃避阳性富集系统,即使是使用多种抗体组合的AdnaTest,也无法完全解决CTC抗原异质性导致的假阴性问[9]。阴性富集策略往往通过抗体靶向、消耗外周血细胞,最常用的是抗CD45抗[10],以高敏感度反向捕获缺乏充分表达EpCAM的CTC。但单独使用此方法时往往降低了细胞纯度,故通常与其他方法结合使用,例如Wu[11]开发的CanPatrol技术先裂解红细胞(RBC),再用磁珠消耗CD45+的白细胞(WBC),在乳腺癌患者血液样本中检测到CTC及肿瘤微栓子。但是这种方法可能导致CK+/CD45+或“双阳性”细胞的CTC被去除以致低估其数[5]。常见的基于生物特性CTC检测技术及其应用特点见表1

表1  常见的基于生物特性CTC检测方法总结
Table1  Summary of common CTC detection methods based on biological characteristics
技术原理标志物检测过的癌种优势缺点
CellSearch® [6-7,9] 基于抗EpCAM抗体涂层的铁磁颗粒,进行免疫磁分离 EpCAM 乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌、膀胱癌 敏感度高,半自动,可重复,获得FDA批准 无法捕获EpCAM表达水平低的CTC,无法进行后续分析
AdnaTest® [9,12] 基于抗体组合的免疫磁分离,通过RT-PCR分析 EpCAM、CEA、MUC-1、HER-2、EGFR、PSA等 乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌 高敏感度和特异性,可进行下游分析 WBC、核酸等污染导致假阳性结果,忽略EpCAM阴性的CTC
MagSweeper [13] 基于抗EpCAM抗体靶向免疫磁珠进行分离 EpCAM 乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌 敏感度高,CTC的纯度高,高处理量 昂贵,CTC被固定无法进行分析,忽略EpCAM阴性的CTC
CanPatrol [11] 基于磁珠去除CD45+的WBC CD45 乳腺癌、鼻咽癌、肺癌、食管癌、肝癌、结肠癌 不依赖EpCAM的表达,可保持CTC活性 特异度低,部分CTC被意外去除

1.2 基于物理特性的方法

CTC以尺寸、密度、可变形性及介电性与血细胞相区别,一些技术据此可以快速分离富集CTC而无需标记。

Drucker[

14]测试了几种方法,其中RosetteSep™使用抗体将血样中的PBMC与RBC交联形成免疫玫瑰花结,然后密度梯度离心将其去除,在MDA-MB-231细胞加标实验中CTC的捕获效率约为40%,在15/28例MBC患者的血样中检测到CTC,ScreenCell™使用微滤器基于细胞大小差异分离CTC,在加标实验中表现为55%的回收率,并在8例MBC患者中的6例检测到CTC,这两种设备在低至2个CTC/mL的水平下保证足够的敏感度。但此类方法容易忽略较小的CTC和与WBC具有相似变形能力的CTC,导致假阴性结果。密度梯度离心法利用了CTC和WBC的比重差异,如Ficoll法和OncoQuick法,后者因结合了离心和过滤而具有更高的捕获[15]。另外,基于CTC与血细胞之间介电性差异,ApoStream®通过介电泳(dielectrophoresis,DEP)进行CTC的富[9],Le Du[16]在47例乳腺癌患者的血样中检测CTC,并联合其他细胞标志物对CTC进行染色区分3种CTC表型(上皮型、间质型、癌症干细胞样CTC)。此方法虽然可以分离出单个CTC,但处理效率较慢,且细胞纯度较低,电场亦会影响细胞表面活性和表面特征,影响后续分[17]

基于免疫亲和力的捕获方法虽然特异度很高,但受限于CTC表面标志物的表达,迄今为止,CTC的异质性使其无法使用通用的特异性抗体来富集。而物理方法摆脱了靶向特定抗原的限制,未经抗体标记的CTC也更利于后续表征分析,但离心、稀释等预处理步骤会损失部分CTC,捕获的CTC纯度并不令人满[

18]。以上大多数CTC检测技术非常耗时,需要熟练的操作人员和昂贵仪器。因此,需要开发新的检测技术,使CTC的检测更加方便、准确和高效。常见的基于物理特性CTC检测技术及其应用特点见表2

表2  常见的基于物理特性CTC检测方法总结
Table 2  Summary of common CTC detection methods based on physical characteristics
技术原理标志物检测过的癌种优势缺点
ISET [19] 基于细胞大小进行过滤 乳腺癌、肺癌、肝癌、结直肠癌、黑色素瘤 敏感度高,简单,价格低,无需标记 特异度低,处理慢,易出现膜堵塞
RosetteSep™ [14] 抗体标记改变细胞密度后,基于密度梯度分离CTC CD45、CD66b、血型糖蛋白A等抗体混合物 乳腺癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌 敏感度高,快速,不依赖EpCAM表达 回收率低,易受WBC、RBC干扰
ScreenCell [14] 基于细胞大小富集CTC 乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、黑色素瘤 快速,价格低,易于生产,可对捕获的CTC分析和培养 特异性差,无法捕获体积较小的CTCRBC干扰
The Ficoll-Paque® [15] 基于密度梯度离心 乳腺癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、前列腺癌 快速方便,价格低,可保持CTC活性 敏感度和特异度低,受离心时间、温度影响
OncoQuick® [15] 基于过滤去除RBC和WBC,并用密度梯度离心富集CTC 乳腺癌、结直肠癌 高敏感度,高通量,价格低,CTC回收率高 特异度低,纯度低,有样品损失
ApoStream® [9,16-17] 基于介电泳原理 乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌 无需标记,快速,可分离单个CTC,可保持CTC活性 通量小,纯度低

2 乳腺癌CTC的微流控芯片检测

微流控技术在CTC检测中的应用出现于最近十几年,微流控技术以高通量和敏感度精确控制微米级的流体和细胞,旨在将所有实验室设备和功能集成到数十毫米尺寸的设备中,并以较低的成本和较短的分析时间对化合物进行微处理和微量分析。与传统方法相比,微流控芯片具有操作自动化、消耗样品少、敏感度高、通量大等优势,并可将过滤、离心、磁选等集成到微尺度[

20]。小型、集成化的微流控芯片实现了CTC富集、分离和分析的一站式过程,显著减少了处理时间并提高捕获效率,为开发真正的即时诊断设备创造了可能。该技术对CTC的检测方法大致可分为两类:基于标记的检测和无标记的检测。

2.1 基于标记的检测

基于标记的方法依赖免疫亲和原理,微流控芯片精确控制流体的流动速度和方向,通过影响CTC表面抗原与抗体的相互作用从而直接影响捕获效率。针对不同的细胞表面抗原,此类方法可以进一步分为正向富集或负向富集。

2.1.1 正向富集

基于CTC的抗原表达,正向富集法最常用的是EpCAM。Nagrath[

21]制作的CTC-Chip利用具有EpCAM抗体涂层的微柱,使用不同类型肿瘤患者的全血样本中进行测试,在115/116个样本中发现了CTC,其中乳腺癌患者(n=10)全血样本分离的CTC数量为5~176个/mL,捕获的平均纯度为60%。随后又进一步开发了人字形芯片(HB-Chip),通过产生微涡流使血细胞被动混合,增强了CTC与抗体包被芯片表面之间的相互作用,其捕获效率比CTC-Chip提升了26.3%。类似地,微柱阵列、混沌混合、几何增强混合和波浪人字形结构等微流控平台,凭借几何功能化微结构可优化免疫捕获效[22-24]。例如借助混沌混[23]和波浪形HB芯[24]的优点制作了T-μFS微流体系统,将10~103个MCF-7细胞加标于200 μL全血中后捕获,效率为83.3%~94.2%,且细胞存活率为94.6%,这为完整、自动地捕获和释放高活性CTC带来可[25]。免疫磁泳法多用EpCAM抗体偶联磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles,MNP),随后在磁场中富集与之结合的CTC。Wang[26]制备了含有抗EpCAM抗体的水凝胶包被的MNP,将MCF-7细胞加标入血液中模拟CTC的捕获,效率约96%,同时检测了5例癌症患者和5名健康志愿者提供的血样,结果在患者血液样本中发现1~12个CTC,而在健康血液样本中未检测到CTC,初步证明了其在临床实践中的实用性。同样,Wu[27]用中性粒细胞膜对免疫磁性纳米颗粒进行表面功能化得到Neu-IMNs,可以同时减少非特异性蛋白质的吸附和WBC的干扰,并增强与CTC的相互作用,成功从19/20个乳腺癌患者血液样本中分离出具有高纯度和高活力的CTC,将其培养并进行了基因突变分析。正向富集依赖特定的标记物保证了高敏感度和纯度,然而一些低表达或不表达EpCAM的“正常样”CTC[28]会减弱检测的敏感度,从而影响对肿瘤的监测和治疗效果的评估。

2.1.2 负向富集

负向富集靶向并去除背景细胞来实现CTC的分离。Mishra[

29]提出LPCTC-iChip,以惯性分离阵列设备去除RBC和血小板,结合高梯度磁性细胞分选仪去除WBC并富集CTC,该团队将荧光标记的乳腺癌CTC掺入健康供体的血样中,回收率为(89.2±5.7)%,并对其进行了分子分析。然而,此方法虽然降低了血细胞被误识别为CTC的可能性,但分离纯度通常较低,因此通常需要多次分离过[30],而且磁场中背景细胞的移动可能会导致部分CTC丢[31]。此外,Szczerba[32]发现CTC-WBC簇的存在将增大乳腺癌转移的潜能,负向富集法可能会意外去除与WBC相关的CTC。基于标记的技术常利用特异性抗体靶向捕获CTC,但这种方法受限于细胞的蛋白质表达。另外,由于抗体不可逆结合且不易降解,抗体标记也会影响CTC的完整性和活[33],因此会影响后续分析。

2.2 基于无标记的检测

无标记法旨在减少使用特异性抗体而导致的误差,既不影响细胞活力和基因表达谱,更有利于CTC的下游分析,并有望实现更高的捕获[

34]。其中主动分选需要借助外力,通常利用电场、磁场、声波或者光学驱动,而被动分选使用特定的通道结构、流体动力或空间位阻来检测CTC,常基于尺寸或惯性力进行分选。

2.2.1 主动分选

主动分选主要通过施加外力操纵细胞来分离CTC。基于细胞的电生理特性,DEP利用介电粒子与电场之间的相互作用将CTC分离、捕[

9,35]。Jahangiri[36]在AC-CSC芯片上施加低频交流电场后,让不同表型的乳腺癌细胞系(MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468)分别通过AC-CSC芯片,发现肿瘤细胞的极化程度相对更低,且不同表型的乳腺癌细胞有其特定的极化频率,同时,将MDA-MB-231细胞与WBC混合来模拟患者血液样本,捕获了约90%的肿瘤细胞。Varmazyari[37]利用基于DEP的微流控装置,在保证细胞活力的情况下将乳腺癌MDA-MB-231细胞与WBC分离,回收率和纯度分别接近95%和100%。类似地,不同细胞在声场下受到不同的力,据此也可将CTC分选、富[33]。例如,Zhang[38]将交变频率声场应用于微流控芯片,实现了从外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中无损分离三种不同的肿瘤细胞(MCF-7、A549、HCT116),即使在CTC与PBMC大小相近情况下也能实现有效分离,有效率高达95%,而PBMC的污染率仅1%,为验证该方法的临床应用可能性,在4例不同类型和阶段的癌症患者中进行测试,平均收集到75.5个CTC/mL。光学微流体系统也可以用来分离CTC[39]。Hu[40]使用叶酸将同源RBC与CTC偶联,得到的CC-RBC具有更大的体积和折射率,因此在光流体系统中的激光照明下可被精确分离,将人乳腺癌MCF-7细胞添加到2 mL血样中测试,保持CTC膜和功能的完整性的同时,达到92%的纯度和90%的回收率。

2.2.2 被动分选

在一项多中心临床试[

41]中,Parsortix®系统基于细胞大小差异富集CTC,对216例MBC患者和205名健康志愿者的外周血进行测试,证明了该系统能够富集CTC并进行后续下游分析,该系统已获得FDA批准用于MBC的CTC富集。依赖物理屏障微结构的建模往往很困难,而利用流体动力学惯性效应,即可实现连续和精确控制流体而无需调节任何微观物理结构。Akbarnataj[42]使用具有梯形横截面的不同曲率半径的螺旋微通道,利用惯性升力结合迪恩涡流产生的拖拽力将CTC聚焦于内部出口,在2.5 mL/min的流速下实现90%的效率,捕获的MCF-7细胞高度存活。Zhu[43]制造了PJMJ微流体分选仪,将肿瘤细胞(A549、H460、MCF-7、H226细胞)加标入WBC中模拟临床样本,实现了90.57%~94.14%的高回收率和48.67%~79.05%的纯度,并且成功从MBC和肺癌患者的血液样本中分离CTC,捕获率为每5 mL样本7~226个CTC,验证了其临床实用性。

无标记策略不会影响细胞活力及基因表达谱,更快的样品处理确保了较大通量,然而CTC的异质性以及与背景细胞的重叠,导致其回收率和纯度并不令人满意。

3 新兴的集成技术及3D打印微流控芯片

目前,对CTC的研究已经不限于单纯枚举数量,已有研究将基于各种原理的检测手段集成在微流控芯片中,结合各自的优势并实现互补,在有效分离和富集CTC后对其进行分子表征,据此可以帮助阐明肿瘤转移机制、寻找治疗靶点及监测药物效应[

44]

Wang[

45]设计了一种楔形微流控芯片,用免疫微粒标记WBC后在明场显微镜下区分CTC并进行全自动化的计数、鉴定,将MCF-7、SK-BR-3等细胞系掺入血液中,通过该芯片的形态识别可快速区分肿瘤细胞并进行捕获。Lee[46]基于免疫磁泳和荧光标记设计了Mag-Gradient芯片,将MNP与HER-2结合,利用3种生物标志物(HER-2、ER和PR)的差异性表达,对4种不同亚型乳腺癌细胞系(BT-474、SK-BR-3、MCF-7和MDA-MB-231)的混合物进行实验,借助磁场和免疫荧光信号完成乳腺癌CTC捕获和分型。Green[47]使用一种双模块微流控设备PillarX,其中Pillar装置基于细胞大小和可变形性,而X-磁装置使用偶联EpCAM抗体的MNP,二者串联来捕获CTC簇和单个CTC,除使用MDA-MB-231荷瘤小鼠进行测试外,在6例MBC患者的血样(500 μL)中成功检测出CTC(12~79个)和CTC簇(5~16个)。Schwab[48]制造的MyCTC芯片,能够在同一集成化设备中对肿瘤细胞进行捕获、培养扩增和药物敏感性测试,在加标癌细胞系样本中的回收率分别为95%~98%和97%~99%,并且成功在1例MBC患者血液样本中捕获了单个CTC和CTC簇。Lv[49]设计了一种近红外(near infrared,NIR)光响应微流控芯片,并通过侧流微阵列(lateral flow microarray,LFM)芯片和光热响应系统的组合,在保证高活性的前提下实现单个CTC的捕获和无损释放,将MCF-7细胞加标到全血中以模拟患者血液样本,捕获的纯度为(90±2)%。

传统的微流控设备基于光刻的制造工艺,复杂的制造步骤、昂贵的材料成本、耗时的制作过程均限制了微流控设备从实验室到实际临床实施的转[

50]。与之相比,3D打印技术具有相对灵活性、直接性和快速原型制作的能力,能够逐层打印出多种复杂的三维结构,增加了微流控芯片的功能表面积,为精确和小型的微流控芯片制造提供便[51],此外,各种适宜的原材料的出现将不断丰富微流控设备的应用范围,促进其在研究和临床环境中被广泛接受。

Chen[

52]等提出了一种3D类河湾截面微流控芯片,主要利用剪切梯度升力与迪恩曳力实现CTC的惯性聚焦及富集,将荧光标记的人乳腺癌MDA-MB-231细胞掺入兔全血进行实验,其最佳回收率和富集比分别可达到95.0%和1.90。本课题[53]使用4台商用3D打印机设计并打印了矩形截面蛇形微流控芯片模型,模拟确定了最佳通道曲率和流速并成功聚焦MCF-7细胞。最近,Chu[54]借助3D打印技术将WBC捕获通道和微滤装置结合在同一微流体设备中,利用抗CD45抗体捕获WBC,同时用过滤器耗竭RBC、血小板等,由此分离富集CTC,将人乳腺癌MDA-MB-231细胞掺入健康志愿者提供的全血中测试设备性能,肿瘤细胞的平均恢复率为91.4%,并且保持了完整性及活力,也在转移性肿瘤患者(前列腺癌、胰腺癌)的外周血样本分离出CTC,表明该装置适用于不同的临床情境。

3D打印微流控芯片可以为CTC检测和早期监测肿瘤转移开辟新机会,可以预测,3D打印技术在未来将会成为微流控芯片制造领域最为重要方法之一,为CTC检测广泛应用于临床提供有益的见解。

4 总结与展望

CTC的检测可以为乳腺癌的进展提供有价值的临床见解,监测患者在治疗期间的反应并为治疗方案的制定提供参考。微流控技术以其成本低廉、操作简单、试剂消耗少、小型化、快速等独特优势,越来越多地应用于CTC分离、鉴定和表征的各项研究中。3D打印技术凭借设计灵活性,克服了微流控设备功能表面积有限的不足,为微流控芯片制造提出了一种更优方案。在未来,期望微流控芯片将常规用于CTC的即时检测,这对研究乳腺癌及其转移机制的研究具有重要意义,将在癌症的早期诊断、预后的观察,以及患者的个性化治疗方面发挥关键作用。

作者贡献声明

尉卓凡负责调研整理文献,设计论文框架,论文撰写,根据修改意见进行论文修订;宁智文负责调研整理文献,对论文中微流控等专业领域部分做出修改解释;胡波负责协助确定研究选题,提供相关研究材料支持,论文修订,对微流控领域相关知识提供见解与指导;袁时芳提出并确定研究选题,确定论文结构框架,明确论文撰写内容,论文修订,给予指导性意见。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突。

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