摘要
共激活因子相关精氨酸甲基转移酶1（CARM1）参与调节RNA和蛋白质的加工。最近的研究揭示其在肿瘤发生和发展中扮演着重要作用。然而，目前仍缺乏CARM1的表达与泛癌预后和免疫微环境的相关性研究。本研究通过生物信息学方法探讨CARM1的表达与泛癌预后和免疫微环境的相关性及其潜在的生物学机制。
使用TCGA、GTEx、HPA数据库探索CARM1在泛癌中的表达情况及其与预后的关系；利用TCGA数据库分析CARM1与泛癌的肿瘤微环境、免疫检查点基因的相关性；通过STRING数据库探讨CARM1互作基因的PPI网络；采用GSEA研究CARM1在泛癌中的潜在生物学机制。
与正常组织相比，CARM1在多数肿瘤组织中的表达水平上调，CARM1的表达与多种肿瘤的预后相关；CARM1的表达与免疫细胞的浸润和免疫检查点的表达相关；富集分析表明CARM1可能通过影响核糖体生物合成改变泌尿系统肿瘤生物学功能；通过影响精氨酸生物合成、DNA复制和细胞周期等影响消化系统肿瘤生物学功能。
最新的恶性肿瘤统计数
TIMER数据库（http://cistrome.dfci.harvard.edu/TIMER）是一个肿瘤免疫细胞浸润分析网络，其提供了免疫、探索和评估三个组件用于研究免疫浸润与遗传或临床结果之间的关联，可以基于TCGA和GTEx数据库分析肿瘤与正常组织间的基因表达差异。本研究使用TIMER数据库，评估了34种癌症组织样本和正常组织样本中CARM1的表达情况并使用方差分析的检验方法进行了统计。
人类蛋白质图集（HPA）（https://www.proteinatlas.org）是基于多种组学方法的人体器官、组织和细胞中蛋白质数据库。为评估CARM1基因在蛋白水平的表达情况，本研究从HPA数据库下载了6种肿瘤组织及其对应正常组织的CARM1蛋白表达的免疫组化图像，包括胃腺癌（STAD）、肝细胞癌（LIHC）、结肠腺癌（COAD）、乳腺癌（BRCA）、肺腺癌（LUAD）和皮肤黑色素瘤（SKCM）。
从TCGA数据库下载泛癌的表达谱数据并提取其临床数据，排除无生存信息的数据，使用Kaplan-Meier方法分析CARM1表达与总生存率（overall survival，OS）和疾病特异性生存率（disease-specific survival，DSS）之间的相关性。R包“survival”用于生存数据的分析、“survminer”用于可视化生存曲线，在本研究中，采用Cox比例风险回归模型对数据进行了统计分析。
TMB被定义为肿瘤中每百万个细胞的碱基突变总数，是可以量化的免疫反应生物标志物，反映了肿瘤细胞的突变数量。TMB可以刺激肿瘤特异性和高免疫原抗体的产生，是预测肿瘤免疫治疗效果的新靶点。MSI是由DNA错配修复异常引起的，其状态可以预测癌症反应或对某些化疗的耐药性。本研究设置相关系数|r|>0.2且P<0.05，采用Spearman的方法计算CARM1的表达和TMB、MSI间的关系。计算和可视化基于R语言“ggplot2”“ggpubr”和“ggExtra”包。
基于TIMER数据库中8种肿瘤的免疫浸润细胞评分，使用R语言“estimate”分析肿瘤样本的免疫和基质评分并采用方差分析（ANOVA）检验方法对结果进行了统计学分析。
肿瘤细胞的免疫相关评分使用CIBERSORT评估方法。使用R语言“immuneeconv”包获得免疫评分，使用R语言“ggplot2”“ggpubr”和“ggExtra”分析和可视化CARM1的表达和细胞免疫浸润之间的相关性。在设定条件为相关系数|r|>0.2且P<0.001的基础上，采用Spearman等级相关分析方法进行统计分析。同时探索了CARM1的表达与检查点相关基因间的相关性。
使用STRING（https://string-db.org）数据库，物种“Homo sapiens”，将参数设置为全网络类型，网络边缘的含义为证据，主相互作用源为实验，最低所需的相互作用评分置信度为0.150和展示相互作用蛋白的数量不超过50个，获得CARM1的蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络。
GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）包含来自TCGA和GTEx数据库的8 587个正常和9 736个肿瘤组织RNA测序数据，包含基因表达、基因相关性、生存分析等功能。使用GEPIA确定了前100个CARM1的相关性基因。本研究将两个结果取交集推测与CARM1关系密切的基因。
TIMER数据库分析显示，CARM1在16种肿瘤组织中异常表达（
图1 CARM1在泛癌中的表达 A：TCGA数据库中，CARM1在34种肿瘤中的表达情况；B：TCGA结合GTEx数据库，CARM1在34种肿瘤中的表达情况；C：HPA数据库中CARM1蛋白的免疫组化染色
Figure 1 The expression of CARM1 in pan-cancer A: Analyze the expression of CARM1 in 34 types of tumors based in the TCGA database; B: Combine the TCGA and GTEx databases to analyze the expression of CARM1 in 34 types of tumors; C: Immunohistochemistry staining of CARM1 protein in the HPA database
由于TIMER数据库中部分肿瘤正常组织数据较少，本研究将TCGA和GTEx数据结合，观察CARM1在肿瘤中的表达情况发现，CARM1在HNSC、肉瘤（SARC）和胸腺瘤（THYM）中差异无统计学意义，在KIRC中其表达下调，在其余的30种肿瘤均表达上调（
对泛癌的生存相关分析表明，在STAD和胃食管癌（STES）中CARM1的表达上调，提示与较好的OS相关，而在胶质瘤（GBMLGG）、低级别胶质瘤（LGG）、KIRC、肾乳头状细胞癌（KIRP）、BLCA、混合肾癌（KIPAN）中提示预后不良（
图2 CARM1的表达与8种肿瘤预后的关系 A：OS；B：DSS
Figure 2 The relationship between CARM1 expression and prognosis in eight types of cancer A: OS; B: DSS
CARM1与TMB、MSI相关性分析显示，在THYM、STES、STAD、LUAD和KIRC中观察到CARM1表达与TMB正相关，在COAD中CARM1表达与TMB负相关。同时CARM1在THYM、STES、STAD、PRAD、LUAD、LUSC、LIHC、KIPAN、GBMLGG、BRCA中表现出与MSI的正相关，在CHOL中表现出负相关（
图3 CARM1表达与TMB及MSI的相关性
Figure 3 The associations of CARM1 expression with TMB and MSI
CARM1与肿瘤微环境相关性分析表明，在STAD、STES和KIPAN中，CARM1表达水平与免疫和基质细胞水平评分呈负相关，但在LGG和GBMLGG中CARM1表达水平与免疫和基质细胞水平评分呈正相关（
图4 CARM1与肿瘤微环境的相关性
Figure 4 The correlation between CARM1 and the tumor microenvironment
CARM1与免疫浸润相关性分析结果表明，在消化系统中，CARM1的表达水平与B cells native、T cells CD4 memory resting、macrophages M0和mast cells resting水平负相关，而在神经系统中，CARM1高表达组的T cells CD4 memory resting、T cells follicular helper、NK cells resting和macrophages M2等浸润水平增高，CARM1表达水平与plasma cells和eosinophils浸润水平负相关（
图5 CARM1与免疫浸润及免疫检查点基因表达的相关性 A：CARM1的表达与4种肿瘤免疫细胞浸润情况的相关性；B：在泛癌中CARM1的表达与免疫检查点基因表达的关系
Figure 5 Correlation between CARM1 and immune infiltration as well as immune checkpoint gene expression A: Correlation between CARM1 expression and immune cell infiltration in four types of cancer; B: Relationship between CARM1 expression and immune checkpoint gene expression in pan-cancer
使用STRING数据库蛋白互作分析获得了50个CARM1潜在相互作用蛋白（
图6 CARM1互作蛋白分析 A：通过STRING数据库获得与CARM1相互作用的PPI；B：STRING数据库和GEPIA分析得到CARM1潜在互作基因
Figure 6 Analysis of CARM1-interacting proteins A: PPI network of CARM1-interacting proteins obtained from the STRING database; B: Potential CARM1-interacting genes identified through STRING and GEPIA analysis
使用R语言进行KEGG功能注释，结果表明CARM1可能通过细胞周期、核糖体生物合成和蛋白酶体途径参与胃癌的发生发展；可能通过脂肪酸代谢、脂肪酸降解和Th1与Th2细胞分化影响脑LGG的生物学功能；可能通过核糖体生物合成、TCA循环、丙酸代谢、脂肪酸代谢和组氨酸代谢途径影响KIRC生物学功能；可能通过核糖体生物合成、氧化磷酸化和亚油酸代谢影响膀胱尿路上皮癌生物学功能。本研究将8种具有预后价值的肿瘤按消化系统、神经系统和泌尿系统进行分类整合，旨在探索同一系统内肿瘤之间潜在的共同生物学机制。分析发现，CARM1可能通过精氨酸生物合成、DNA复制和细胞周期等影响消化系统肿瘤的生物学功能；通过核糖体途径影响泌尿系统肿瘤生物学功能。使用R软件GSEA基于Hallmark进行富集分析中，CARM1在胃癌细胞中显著富集于在E2F目标基因、MYC靶基因V2和G2检查点等通路；在KIRC中，CARM1在上皮-间质转化、G2检查点和异体排斥等通路；在多形性胶质母细胞瘤中CARM1显著富集于上皮-间质转化、有丝分裂纺锤体和G2M检查点等通路（
图7 CARM1通路富集分析 A：CARM1的KEGG富集分析和GSEA基于Hallmark进行的富集分析；B：不同系统肿瘤的潜在共同生物学机制
Figure 7 Pathway enrichment analysis of CARM1 A: KEGG enrichment analysis of CARM1 and GSEA enrichment analysis based on Hallmark gene sets; B: Potential common biological mechanisms in different system tumors
基于生物信息学手段进行的泛癌研究可以更全面地评估基因与各个肿瘤间的关系，近年来备受关注。本研究结合TCGA、GTEx、HPA数据库进行泛癌分析发现，CARM1在多种肿瘤组织中高表达，HPA数据库的免疫组化图片也从蛋白质角度证实这一趋势；同时CARM1的表达与多种肿瘤预后相关，与免疫微环境、TMB和MSI相关，可能通过核糖体、细胞周期等机制参与肿瘤的发生发展。
既往关于CARM1与肿瘤的研
肿瘤细胞、基质细胞、免疫细胞和细胞外基质共同组成了免疫微环
另外，本研究发现肿瘤组织中CARM1的表达与CD274、CTLA4、HAVCR2、LAG3、PDCD1、PDCD1LG2和SIGLEC15均正相关。免疫检查点如PD-1通过与其配体PD-L1结合，抑制免疫细胞活性，帮助肿瘤细胞逃避免疫系统的监测和攻
富集分析表明，在泌尿系统中CARM1可能通过核糖体途径影响生物学功能；snoRNA激活核仁中的PARP-1催化活性，活化PARP-1 ADP-核糖基DDX21，促进DDX21核苷酸定位、rDNA转录和核糖体生物发
对STRING数据库和GEPIA分析，发现CUL1和CARM1间存在潜在的相互作用关系。CUL1是SCF E3泛素连酶复合物的核心成分，该复合体负责催化蛋白质的泛素化，调控细胞周期进展、信号转导和蛋白质的泛素化降解。有研
本研究的局限性在于主要依赖于生物信息学探究问题，缺少体内外实验对其在肿瘤中的作用机制进一步验证。尽管如此，本研究显示CARM1在多数肿瘤中是高表达，并可能成为肿瘤的预后标志物和潜在免疫治疗潜在靶点。同时，本研究通过富集分析为CARM1在不同系统肿瘤中的作用机制研究提供一定的参考价值。还需通过实验进一步揭示CARM1在肿瘤免疫治疗中的潜力，为其作为免疫治疗靶点提供更有力的实验依据。结合不同免疫治疗策略进一步评估CARM1的临床应用前景。
作者贡献声明
平苗苗、李光耀负责实验设计、文章撰写；李启娇、王星星负责实验设计、文章修改；郭继政负责研究指导、文章审阅和经费支持。
利益冲突
所有作者均声明不存在利益冲突。
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