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肝细胞癌中PD-L1表达与STAT3/PRKDC/MYC信号通路的关系研究

  • 田芳铭
  • 刘鑫
  • 唐浩程
  • 张恺
  • 郭臣
  • 施智甜 ✉
昆明医科大学第二附属医院 肝胆胰外科二病区，云南 昆明 650000

中图分类号： R735.7

最近更新：2025-02-10

DOI：10.7659/j.issn.1005-6947.240281

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EN 引
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摘要

背景与目的

目前，肝细胞癌（HCC）的治疗仍面临复发和转移的严峻挑战，而肿瘤免疫逃逸是导致这些问题的关键机制之一。信号转导与转录激活因子3（STAT3）作为重要的转录因子，在多种恶性肿瘤中呈现过度激活状态，不仅参与肿瘤的发生与进展，还与肿瘤免疫逃逸密切相关。程序性死亡配体1（PD-L1）是关键的免疫检查点，其表达上调能够帮助肿瘤细胞逃避免疫监视，从而抑制抗肿瘤免疫。研究显示，STAT3可能通过与蛋白激酶DNA激活催化多肽（PRKDC）的相互作用激活骨髓细胞瘤病毒癌基因（MYC）信号通路，进而促进PD-L1的表达并诱导免疫逃逸。然而，STAT3/PRKDC/MYC轴在HCC中的具体作用机制尚不明确。本研究旨在揭示STAT3通过PRKDC/MYC信号通路调控PD-L1表达并可能诱导HCC免疫逃逸的分子机制，以期为HCC免疫治疗提供潜在靶点。

方法

用qRT-PCR和Western blot检测人正常肝细胞（HL-7702）与人HCC细胞（HuH-7、HepG2）中STAT3的表达。构建敲低STAT3（si-STAT3）和过表达PRKDC（oe-PRKDC）质粒，以及各自的阴性对照（si-NC、oe-NC）质粒，按实验设计分别转染至HCC细胞（HuH-7）中，以无处理的HuH-7细胞为空白对照。采用Western blot分析各组细胞STAT3、PRKDC、PD-L1和MYC通路相关蛋白的表达。采用CCK-8、Transwell、划痕试验和流式细胞术评估HCC细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡。将HuH-7细胞与人外周血单个核细胞（hPBMC）共培养后，采用ELISA法检测免疫调节因子干扰素γ（IFN-γ）的含量。采用免疫共沉淀和免疫荧光共定位验证STAT3与PRKDC蛋白之间的相互作用。

结果

qRT-PCR和Western blot结果显示，HCC细胞中STAT3的mRNA和蛋白表达水平均明显升高（均P<0.05）。功能实验结果显示，si-STAT3组HCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显减弱，细胞凋亡明显升高；PD-L1和MYC通路相关蛋白的表达水平明显下调；与hPBMC共培养后IFN-γ的分泌水平明显升高（均P<0.05）。与oe-PRKDC质粒共培养后，STAT3敲低对HCC细胞的以上影响均被明显逆转（均P<0.05）。Scansite 4.0数据库分析结果显示，STAT3与PRKDC存在结合位点，免疫共沉淀与免疫荧光共定位实验表明STAT3与PRKDC蛋白的相互作用。

结论

STAT3在HCC细胞中高表达，并可通过与PRKDC相互作用促进HCC细胞增殖、迁移和侵袭以及免疫逃逸，抑制细胞凋亡，并激活MYC通路，增加PD-L1表达，STAT3/PRKDC/MYC轴可能是HCC免疫治疗的潜在靶点。

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）作为原发性肝癌的主要类型，已成为全球病死率和发病率较高的癌症之一[

1]。中国的HCC发病率和病死率高于全球平均水平，HCC的预防和治疗对于中国患者而言更加迫切[2]。目前HCC的治疗包括手术切除、肝移植、介入、放射治疗、化学治疗和靶向免疫治疗等，但因HCC细胞的高侵袭性和易转移能力，使得治疗效果依旧不佳，再加上昂贵的费用，给患者带来了严重的经济负担[3]。因此，迫切需要寻找新的诊断和治疗手段。

肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）在肿瘤的进展中发挥着重要作用，TME内的免疫细胞倾向于在肿瘤发生的早期阶段靶向杀死癌细胞，但癌细胞可以通过各种机制逃避免疫监视[

4]，即免疫逃逸。免疫逃逸在HCC的恶性进展中具有至关重要的作用[5]。免疫疗法是一种重要的治疗策略，而免疫逃逸可降低抗肿瘤治疗的疗效[6]。骨髓细胞瘤病毒癌基因（MYC）是一种致癌基因，与各类癌症的发生、发展和恶性侵袭密切相关[7]。MYC作为一种调节各类癌细胞的生长分化、血管生成和免疫反应的转录因子，越来越多的研究关注其在TME和免疫效应过程中的功能机制[8]。先前研究[9]已表明，MYC在抗肿瘤免疫反应中具有重要作用，其不仅促进癌细胞增殖和分化，还有助于癌细胞免疫逃逸。伴侣蛋白2（CCT2）和染色盒蛋白同源物3（CBX3）是MYC通路的相关蛋白。CCT2是胞质伴侣蛋白的一个亚基，调节许多肿瘤相关蛋白和细胞周期，在HCC中发现其升高[10]。CBX3是染色体盒结构域蛋白家族中的一种，CBX3高表达与HCC患者预后不良相关，CBX3过表达可促进肿瘤进展[11]。程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）是淋巴细胞表面的一种免疫抑制受体，在维持免疫自我耐受中起着关键作用。PD-1受体有PD-L1和PD-L2两种配体。PD-L1在肿瘤细胞上表达，是PD-1的主要配体，PD-L1与PD-1结合，使肿瘤细胞逃避宿主免疫反应[12]。

信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）已被证实对大多数癌症具有促癌作用，可以促进细胞增殖、分化和血管生成[

13]。抑制STAT3的激活是抗癌治疗的重要策略之一[14]。先前研究[15]已报道，STAT3在人类HCC中具有重要作用，通过靶向抑制STAT3可以促进HCC细胞的凋亡，抑制炎症反应。阻断STAT3的激活可改善HCC的TME和抗肿瘤免疫反应[16]。STAT3被证实通过调节各种炎症相关基因而发挥作用，激活STAT3能促进血管内皮生长因子的表达，进一步介导人胰腺癌血管生成和转移[17]。蛋白激酶DNA激活催化多肽（protein kinase DNA-activated catalytic polypeptide，PRKDC）作为一种DNA依赖性蛋白激酶，在维持基因稳定性中具有关键作用[18]。PRKDC与DNA损伤修复相关，参与多种癌症的恶性进展和转移，如前列腺癌[19]、喉鳞状细胞癌[20]等。在乳腺癌中发现，PRKDC高表达通过p38 MAPK信号传导促进乳腺癌细胞生长，并与较低的存活率相关[21]。然而STAT3和PRKDC在HCC免疫逃逸中的作用尚未阐明。本研究通过Western blot分析STAT3、PRKDC、PD-L1和MYC通路相关蛋白的表达水平，CCK-8、Transwell、划痕试验和流式细胞术评估HCC细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡，免疫共沉淀和免疫荧光验证STAT3与PRKDC蛋白之间的相互作用，进一步探讨STAT3与PRKDC通过激活MYC通路、增加PD-L1表达及诱导HCC免疫逃逸的作用机制，为HCC的免疫治疗寻找新的有效的生物标志物。

1 材料与方法

1.1 细胞与培养

人正常肝细胞HL-7702（CL-0111）、人HCC细胞HuH-7（CL-0120）和HepG2（CL-0103）均购于武汉普诺赛生命科技有限公司，人外周血单个核细胞（hPBMC）SNP-H287购于武汉尚恩生物技术有限公司，细胞分别通过含10% FBS（Gibco，美国）和1%双抗（Sigma-Aldrich，美国）的RPMI-1640和DMEM细胞培养液（Sigma-Aldrich，美国）进行培养。并将其置于含5% CO2、37 ℃细胞恒温培养箱内孵育，当细胞生长至培养皿的90%时进行传代培养。

1.2 细胞转染

取出培养好的HuH-7细胞，按照1×105/孔的浓度转移到24孔板中，构建STAT3特异性siRNA质粒（si-STAT3）与PRKDC过表达（oe-PRKDC）质粒，以及各自的阴性对照（si-NC、oe-NC）质粒（GenePharma，中国），采用Lipofectamine 3000试剂（Invitrogen，美国）将其分别转染到细胞中，参照试剂厂家说明书在无菌环境下进行细胞转染，并将其置于含5% CO2的细胞恒温（37 ℃）培养箱内孵育48 h，采用qRT-PCR评估转染效果。

1.3 qRT-PCR检测STAT3、PRKDC、GAPDH表达

收集各组细胞，采用TRIzol试剂（Invitrogen）提取总RNA。按照One Step Prime Script miRNA cDNA Synthesis Kit（Takara，日本）试剂盒操作步骤将RNA反转录合成单链互补DNA（cDNA），采用SYBR Green PCR Master Mix（Life Technologies，美国）试剂盒进行qRT-PCR扩增，并检测mRNA水平。以GAPDH作为基因内参，采用2-ΔΔCt方法[

22]计算STAT3、PRKDC、GAPDH表达水平。本实验所用的所有引物序列见表1。

表1  PCR引物序列
Table 1  PCR primer sequences
基因序列（5'→3'）
STAT3
正向 5'-CTT GGG TGG AGA AGG ACA-3'
反向 5'-ATC GGC AGG TCA ATG GTA-3'
PRKDC
正向 5'-CCC CTC ATC AGT GGT TTC-3'
反向 5'-TTC CCA GTT ATT CTT GGT CTCA-3'
GAPDH
正向 5'-TGA CCA CAG TCC ATG CCA TCA C-3'
反向 5'-CGC CTG CTT CAC CAC CTT CTT-3'

1.4 Western blot检测细胞蛋白

收集各组细胞提取总蛋白，采用10% SDS-PAGE凝胶进行分离后，通过湿转到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上（Millipore，美国）。置于常温下，加入5%脱脂牛奶放于摇床上2 h进行封闭膜，清洗后加入一抗，将其置于4 ℃冰箱中孵育过夜，于第2天取出加入HRP conjugated二抗（1∶2 000，cat.no.ab205718，Abcam，英国），置于常温1 h。使用ECL化学发光液显影（BD Biosciences），化学发光仪进行曝光和观察，使用Image J分析蛋白条带。以anti-GAPDH抗体（1∶1 000，cat.no.ab181602，Abcam，英国）为对照。一抗包括：anti-STAT3（1∶1 000，ab68153，Abcam，英国），anti-p-STAT3（1∶20 000，ab76315，Abcam，英国），anti-PRKDC（1∶1 000，ab32566，Abcam，英国），anti-PD-L1（1∶1 000，ab213524，Abcam，英国），anti-c-MYC（1∶1 000，ab32072，Abcam，英国），anti-CCT2（1∶10 000，ab92746，Abcam，英国），anti-CBX3（1∶1 000，ab213167，Abcam，英国）。

1.5 ELISA测定干扰素γ（IFN-γ）含量

将hPBMC与植物血凝素（PHA）（MERCK，美国）共孵育作为PHA组，未与PHA共孵育的hPBMC作为空白对照组。将si-NC和si-STAT3以及oe-PRKDC转染至HuH-7细胞后，与hPBMC共培养，随后与PHA共孵育，分别记作hPBMC+si-NC组，hPBMC+si-STAT3组和hPBMC+si-STAT3+oe-PRKDC组，提取细胞上清液采用人IFN-γ ELISA试剂盒（ml077386，上海酶联生物，中国）检测IFN-γ的含量，检测方法严格按照试剂盒说明书执行。

1.6 STAT3与PRKDC蛋白相互作用预测

应用Scansite 4.0数据库（https://scansite4.mit.edu/#scanProtein）预测STAT3与PRKDC的蛋白相互作用。

1.7 免疫共沉淀实验

收获细胞使用IP裂解缓冲液裂解，离心提取上清液。获取蛋白后分别采用含Protein A/G磁珠（Santa Cruz Biotechnology）与第一抗体anti-STAT3和anti-PRKDC在4 ℃下置于摇床上缓慢振荡孵育60 min，随后加入清洗液冲洗3次。离心管置于磁珠悬架上进行洗脱，收集洗脱液，随后采用Western blot 进行检测 ，以验证STAT3和PRKDC的相互作用。

1.8 免疫荧光共定位实验

收集细胞并将其转移到24孔板（2×104细胞/孔）中培养。24 h后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤2次，加入4%多聚甲醛固定细胞30 min，0.5% Triton X-100渗透10 min，使用牛血清白蛋白封闭1 h。随后，细胞与抗体STAT3（1∶200，ab68153）和PRKDC（1∶200，ab32566）进行双染，置于4 ℃冰箱孵育过夜。第2天，清洗一抗后加入相应的二抗孵育1 h，DAPI染色，在荧光显微镜（400857，NiKon，日本）下观察染色细胞并拍摄图像。

1.9 CCK-8实验

采用CCK-8分析试剂盒（北京碧云天生物技术公司）进行细胞增殖水平检测，按照试剂盒说明进行实验。收集各组处理后的细胞，迅速按3×103个/孔的浓度分别加入96孔板中，每组设置6个重复孔。弃去原培养液，重新加入100 μL细胞培养液，再加入10 μL CCK-8溶液，于37 ℃避光孵育1~3 h。使用酶标仪在450 nm处测量所有吸光度值。

1.10 Transwell检测细胞侵袭

取各组对数生长期细胞，侵袭实验在Transwell小室（Corning，美国）中进行，各组细胞采用无血清DMEM培养基调整浓度为1×105个/mL。将Transwell小室上室中均匀涂满Matrigel，然后吸取200 μL细胞悬液到上室中。吸取600 μL含10% FBS的DMEM细胞培养液到24孔板下室中，培养24 h，将结晶紫染色液（Solarbio，中国）加入下室细胞进行染色，于倒置显微镜下（CKX53，OLYMPUS，日本）观察每个孔内固定位置的细胞数量，并选取5个视野进行计数拍照，计算平均值。

1.11 细胞划痕试验检测细胞迁移

收集各组处理后细胞，以2.5×105个细胞/孔的浓度均匀迅速吸取到24孔板中，将其置于细胞恒温（37 ℃）培养箱内孵育，观察细胞生长到90%以上的密度时，采用1 mL的无菌枪头进行划痕后，加入PBS缓慢清洗多余细胞，加入不含FBS的DMEM细胞培养液，采用倒置显微镜拍照记录，将24孔板再置于细胞恒温培养箱，24 h后进行拍照记录，采用Image J进行分析。

1.12 流式细胞术检测细胞凋亡

收集各组处理后细胞，采用胰蛋白酶消化的各组细胞。调整细胞浓度为1×105个细胞/培养皿，使用提前预冷的PBS洗涤2次，采用Annexin-V-FITC/PI凋亡试剂盒（Absin，中国）检测其凋亡率。使用FlowJo-V10软件处理实验结果。

1.13 统计学处理

采用Graphpad Prism 8进行数据分析和绘制统计图，计量资料采用均数±标准差（x¯±s）表示，两组间比较采用t检验，组间比较采用双向方差分析（two-way ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结　果

2.1 STAT3在HCC细胞系中表达情况

qRT-PCR和Western blot检测结果显示，与人正常肝细胞HL-7702比较，人HCC细胞中STAT3 mRNA明显上调，STAT3明显活化（p-STAT3/STAT3）（均P<0.05）（图1），上述变化在HuH-7细胞中较HepG2更为明显，因此后续实验选用HuH-7进行研究。

图1  STAT3表达检测　　A：qRT-PCR；B：Western blot

Figure 1  STAT3 expression determination　　A: qRT-PCR; B: Western blot

2.2 STAT3转染效率检测

将si-NC和si-STAT3分别转染至HuH-7细胞后，与空白对照组HuH-7细胞比较，si-NC组HuH-7细胞STAT3 mRNA与蛋白表达差异均无统计学意义（均P>0.05），而si-STAT3组HuH-7细胞STAT3 mRNA与蛋白表达明显降低（均P>0.05）（图2）。

图2  转染效率检测　　A：qRT-PCR检测STAT3 mRNA表达；B：Western blot检测STAT3蛋白的表达

Figure 2  Transfection efficiency detection　　A: Detection of STAT3 mRNA expression by qRT-PCR; B: Detection of STAT3 protein expression by Western blot

2.3 STAT3对HCC生物学功能的影响

2.3.1 细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡情况

与空白对照组比较，si-NC组细胞增殖能力、细胞侵袭和迁移能力、凋亡率差异均无统计学意义（均P>0.05），而si-STAT3组细胞增殖能力明显减弱、细胞的侵袭和迁移能力明显降低、凋亡明显升高（均P<0.05）（图3）。

图3  STAT3对HCC细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响　　A：CCK-8分析；B：划痕愈合分析；C：Transwell评估侵袭能力；D：流式细胞术检测细胞凋亡

Figure 3  Effect of STAT3 on HCC cell proliferation, invasion, migration, and apoptosis　　A: CCK-8 analysis; B: Wound healing assay; C: Transwell assay to evaluate invasion ability; D: Flow cytometry analysis of cell apoptosis

2.3.2 PD-L1及MYC通路相关蛋白的表达情况

Western blot检测结果显示，与空白对照组比较，si-NC组的各蛋白表达水平差异均无统计学意义（均P>0.05），而si-STAT3组PD-L1以及c-MYC、CCT2和CBX3的蛋白表达水平均明显降低（均P<0.05）（图4）。

图4  PD-L1和MYC通路相关蛋白表达检测

Figure 4  Detection of expressions of PD-L1 and MYC pathway-related proteins

2.3.3 各组IFN-γ分泌量

与未处理的hPBMC细胞比较，PHA组hPBMC细胞 的IFN-γ分泌明显升高（P<0.05），hPBMC+si-NC组hPBMC细胞的IFN-γ分泌水平差异无统计学意义（P>0.05），hPBMC+si-STAT3组hPBMC细胞的IFN-γ分泌水平明显升高（P<0.05）（图5）。

图5  各组IFN-γ分泌水平比较

Figure 5  Comparison of IFN-γ secretion levels among different groups

2.4 STAT3与PRKDC蛋白相互作用

Scansite 4.0数据库分析发现，STAT3与PRKDC蛋白之间存在结合位点（图6A）。免疫共沉淀验证结果显示，STAT3与PRKDC存在蛋白相互作用关系（图6B）。采用免疫荧光共定位实验检测细胞内STAT3与PRKDC的表达情况，结果显示，STAT3和PRKDC均在HuH-7细胞表达，且共定位于细胞核质中，在si-STAT3组中STAT3和PRKDC的表达均明显减少（图6C）。

图6  STAT3与PRKDC蛋白的相互作用　　A：结合位点图；B：免疫共沉淀实验；C：免疫荧光共定位（比例尺=20 µm）

Figure 6  Interaction between STAT3 and PRKDC proteins　　A: Binding site map; B: Co-immunoprecipitation assay; C: Immunofluorescence co-localization (scale bar=20 µm)

2.5 STAT3与PRKDC共转染对HCC生物学功能的影响

2.5.1 PRKDC转染效率

为了进一步明确STAT3与PRKDC在HCC的进展中的作用机制，本研究将oe-PRKDC共转染至HuH-7细胞中，qRT-PCR与Western blot检测结果显示，与空白对照组比较，oe-NC组PRKDC mRNA与蛋白表达差异均无统计学意义（均P>0.05），而oe-PRKDC组PRKDC mRNA与蛋白表达明显升高（均P<0.05）（图7）。

图7  测转染效率检测　　A：qRT-PCR检测PRKDC mRNA表达；B：Western blot检测PRKDC蛋白的表达

Figure 7  Transfection efficiency detection　　A: Detection of PRKDC mRNA expression by qRT-PCR; B: Detection of PRKDC protein expression by Western blot

2.5.2 细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡情况

检测结果显示，oe-PRKDC共转染后，STAT3敲低对细胞增殖、侵袭与迁移能力的抑制以及对细胞凋亡的促进作用被明显逆转（均P<0.05）（图8）。

图8  STAT3与PRKDC相互作用对HCC细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响　　A：CCK-8分析；B：划痕愈合分析；C：Transwell评估侵袭能力；D：流式细胞术检测细胞凋亡

Figure 8  Effect of STAT3 and PRKDC interaction on HCC cell proliferation, invasion, migration, and apoptosis　　A: CCK-8 analysis; B: Wound healing assay; C: Transwell assay to evaluate invasion ability; D: Flow cytometry analysis of cell apoptosis

2.5.3 PD-L1和MYC通路相关蛋白表达情况

检测结果显示，oe-PRKDC共转染后，STAT3敲低所致的PD-L1、c-MYC、CCT2和CBX3的蛋白表达水平下调被明显逆转（均P<0.05）（图9）。

图9  STAT3与PRKDC相互作用对HCC细胞PD-L1和MYC通路相关蛋白表达的影响

Figure 9  Effect of STAT3 and PRKDC interaction on PD-L1 and MYC pathway-related protein expression in HCC cells

2.5.4 IFN-γ的分泌情况

检测结果显示，oe-PRKDC共转染后，STAT3敲低所致的IFN-γ分泌增加被明显逆转（P<0.05）（图10）。

图10  各组IFN-γ分泌水平比较

Figure 10  Comparison of IFN-γ secretion levels among different groups

3 讨　论

HCC是一种发病率和病死率都位居高位的恶性肿瘤之一，尤其是在中国，HCC的高发病率和致死率严重威胁着中国人民的生命安全，再加上昂贵的治疗费用带来了严重的经济负担[

23]。HCC的进展是一个复杂的调控过程，包括伴随的炎症损伤，肝细胞坏死和病毒感染等[24]。目前，HCC的治疗主要是以手术为主的综合治疗，但HCC患者在接受治疗后仍然会发生较大概率的复发或癌细胞转移[25]。研究[26]证实，癌细胞的免疫逃逸是造成癌症复发和转移的主要原因。因此，寻找新的有效的HCC细胞免疫逃逸生物标志物具有重要意义。

STAT3是激活因子蛋白家族的成员之一，具有介导细胞信号传递，参与各种生物学过程，包括细胞增殖、分化、凋亡和血管形成[

27]。STAT3被发现在各种人类恶性肿瘤中过度激活，与肿瘤发生、转移和耐药机制相关[28]。在HCC中，STAT3同样被发现在HCC细胞中被激活[29]，并促进肿瘤进展[30]。本研究也证明STAT3在人HCC细胞系HuH-7和HepG2中被激活，表达显著上调。TME对于癌症的进展和治疗具有至关重要的功能，过度激活的STAT3会影响免疫因子的表达，进而在肿瘤细胞中发挥免疫逃逸作用[31]。先前研究[32]表明，STAT3是肿瘤细胞和TME细胞（尤其是肿瘤浸润免疫细胞）的重要信号节点，靶向抑制STAT3是恢复抗肿瘤免疫，改善肿瘤细胞免疫抑制的有效策略。免疫检查点失调是各种癌细胞发生免疫逃逸的关键因素，进而促进癌症的发展和恶性侵袭。PD-L1是关键的免疫检查点之一[33]，PD-L1在肿瘤细胞逃避宿主免疫系统的能力中起着关键作用，并且PD-L1蛋白在人HCC中表达上调促进细胞免疫逃逸[34]。STAT3已被证明与PD-L1启动子结合以转录方式调节其表达，进而诱导免疫细胞凋亡，抑制T细胞致死，促进肿瘤免疫逃逸[35]。STAT3在HCC中被发现是有效的作用靶点，靶向抑制STAT3在体内体外均有效抑制HCC细胞恶性进展，诱导细胞免疫性死亡[30]。本研究中进一步评估了敲低STAT3后HCC细胞中PD-L1和MYC通路相关蛋白（c-MYC、TCP1亚基的CCT2[36]和CBX3[37]）的蛋白表达水平，证明敲低STAT3可下调MYC通路。IFN-γ是免疫调节因子，在癌细胞免疫逃逸中具有重要作用。Chen等[38]已证实，抑制表皮生长因子受体（EGFR）或使用替莫唑胺可以降低PD-L1的表达，并进一步增强hPBMC与癌细胞共培养后IFN-γ的产生，从而促进非小细胞肺癌或多形性胶质母细胞瘤[39]免疫逃逸。本研究结果显示，敲低STAT3可以显著抑制HCC细胞增殖、迁移和侵袭，以及PD-L1的表达，并下调MYC通路。此外，敲低STAT3进一步增加了HuH-7细胞与hPBMC共培养后IFN-γ的分泌水平。

MYC在肿瘤的发展和免疫调节中具有重要作用，MYC的过表达促进了癌细胞的增殖和分化，促进了癌症的发生与发展。此外，MYC的激活会对抗原传递、T细胞识别以及T细胞和NK细胞介导的细胞免疫应答产生影响，从而促进了癌细胞免疫逃逸[

9]。在三阴性乳腺癌中发现，MYC过表达导致TME的免疫浸润，抑制T细胞的功能从而促进肿瘤的发展[40]。研究[11]证实，MYC与PD-L1之间存在结合位点，低表达的甲基转移酶样5（METTL5）通过抑制MYC通路下调PD-L1的表达，从而抑制HCC细胞的免疫逃逸。本研究发现，STAT3与PRKDC存在结合位点，并在HuH-7细胞中发生蛋白相互作用。DNA修复在癌症中发挥了关键作用，DNA修复基因被证实是恶性肿瘤治疗的潜在靶点[41]。PRKDC被确定为一种常见的癌症突变DNA修复基因[42]，包括HCC。此外，PRKDC调控了癌细胞的增殖、克隆和分化，在乳腺癌中，PRKDC被证实异常高表达，并促进了细胞的增殖、侵袭和分化[43]。缺乏PRKDC突变的癌症，会影响蛋白质的功能和免疫疗法的疗效，敲除PRKDC增强了结直肠癌细胞的抗PD-L1抗体作用[44]。有研究[45]报道，发生PRKDC突变的肿瘤患者对免疫治疗具有更为强烈的反应，PRKDC会抑制免疫应答而进一步促进恶性肿瘤的发展，过表达的PRKDC会促使免疫检查点蛋白PD-L1上调，抑制其降解，进而发挥免疫抑制功能，促进癌细胞的免疫逃逸。其次，先前研究发现PRKDC是HCC预后相关的差异表达基因之一[46]，抑制PRKDC可以进一步抑制乙型肝炎病毒转录[47]。本研究结果进一步表明，STAT3与PRKDC相互作用，PRKDC逆转了STAT3敲低对HCC细胞增殖、迁移和侵袭以及PD-L1的表达和MYC通路的抑制作用。同样，过表达PRKDC逆转了STAT3敲低对IFN-γ的分泌的促进作用，进一步减少了IFN-γ的分泌。

综上所述，本研究结果证实，STAT3通过与PRKDC相互作用促进HCC细胞增殖、迁移和侵袭以及免疫逃逸，并与MYC通路有关。STAT3与PRKDC蛋白互作可能是HCC免疫治疗的有效潜在靶点，然而本研究只在细胞层面证实STAT3与PRKDC在HCC细胞进展中的作用，后续研究还应进一步通过体内模型以及临床加以验证，其次还需进一步明确STAT3、PRKDC与MYC通路在HCC中的具体作用机制。

作者贡献声明

田芳铭主要参与实验研究思路构思、实验方法设计、细胞实验、数据整理、实验数据分析及论文撰写等；施智甜主要参与论文研究思路构思、实验方法设计、实验实施、论文审核及修订等；刘鑫、唐浩程、张恺、郭臣主要参与细胞实验，数据整理，实验数据分析等。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突。

参考文献

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