摘要
溶质载体家族2成员1（SLC2A1）基因编码的葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）与糖酵解途径密切相关，而糖酵解是恶性肿瘤供能的主要生理途径，因此，SLC2A1可能与多种恶性肿瘤的发生发展有关。鉴于SLC2A1在肝细胞癌（HCC）中的表达及生物学功能并不完全清楚，本研究通过生物信息学方法和临床研究探讨SLC2A1在HCC中的表达及意义。
从癌症基因组图谱数据库（TCGA）下载HCC患者的RNA-seq数据与临床信息，分析SLC2A1在HCC中的表达、预后价值，以及对不同SLC2A1表达水平HCC患者差异表达基因做富集分析和相关性分析。收集江苏省苏北人民医院80例临床HCC患者的手术标本与临床病理资料，分析SLC2A1在HCC中的表达情况，以及SLC2A1表达水平与患者临床病理特征、预后的关系，并筛选影响患者预后的独立危险因素。
TCGA数据库分析结果显示，SLC2A1 mRNA在HCC中高表达，并且高表达患者的总生存期（HR=2.50，95% CI=1.76~3.56，P<0.001）、疾病特异性生存期（HR=2.13，95% CI=1.34~3.37，P=0.001）和无复发间期（HR=1.42，95% CI=1.05~1.93，P=0.025）均明显差于低表达患者；其表达水平与RNA甲基化、免疫细胞浸润程度有关（均P<0.05）。80例患者临床病理资料的比较分析结果显示，SLC2A1蛋白在HCC组织中的表达明显高于癌旁组织（P<0.05）；SLC2A1表达水平与TNM分期、乙型病毒性肝炎和血管侵犯明显有关（均P<0.05）。单因素分析显示，TNM分期（HR=1.921，95% CI=1.365~1.554，P=0.01）、血管侵犯（HR=1.925，95% CI=1.253~2.958，P=0.003）、乙型病毒性肝炎（HR=1.365，95% CI=0.624~1.654，P=0.029），甲胎蛋白（HR=1.629，95% CI=1.063~2.479，P=0.025）和SLC2A1（HR=1.934，95% CI=1.261~2.965，P=0.002）与患者预后有关，多因素分析表明，血管侵犯（HR=1.657，95% CI=1.036~2.652，P=0.035）和SLC2A1（HR=1.753，95% CI=1.132~2.715，P=0.012）是HCC患者预后的独立危险因素。
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是肝癌的主要类型，其发病率呈逐年上升趋势，是最严重的癌症类型之
溶质载体家族2成员1（solute carrier family 2 member 1，SLC2A1）基因编码的葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1）是一种具有高葡萄糖亲和力的葡萄糖转运蛋白，可通过提高肿瘤细胞的糖酵解能力来促进肿瘤细胞的增
HCC患者SLC2A1的RNA-seq数据来源于癌症基因组图谱数据库（The Cancer Genome Atlas，TCGA）（https://portal.gdc.cancer.gov
用stats[4.2.1]完成SLC2A1的表达分析，ggplot2[3.3.6]包对数据进行可视化。用survival[3.3.1]进行生存分析，并进行比例风险假设检验和拟合生存回归；结果用survminer包以及ggplot2[3.3.6]包进行可视化。
从TCGA数据中提取SLC2A1对应分子的数据。然后，采用DESeq2包对选择的公共数据的原始Counts矩阵进行差异分析。在筛选出差异表达基因后，选取与SLC2A1最密切相关的450个基因，clusterProfiler[4.4.4]包对相关基因进行GO和KEGG富集分析。
TIMER数据库（https://cistrome.shinyapps.io/timer）包括来自TCGA数据库的基因表达谱；用于评估恶性肿瘤中免疫细胞的浸润状态及其临床疗
将肿瘤组织和正常组织样本行免疫组化前，用福尔马林固定、石蜡包埋。将蜡块标本切成4 μm厚的薄片。将样本组织切片进行脱蜡处理，接下来对其进行抗原修复，然后添加内源性过氧化物酶阻断剂用来阻断内源性过氧化物酶活性。阻断抗原后，加入SLC2A1的一抗（Rabbit，1∶1 200，No. abs118441，absin，中国），4 ℃冰箱中孵育过夜；再加入二抗（Rabbit，1∶2 000，No. abs50038，absin，中国）室温下孵育1.5 h；随后加入辣根酶标记链霉亲和素工作液促进抗原抗体结合。最后采用DAB显色试剂盒（ZLI-9018，ZSBIO）和苏木精染色液（BA4097，Baso）染色检测免疫反应细胞。Aipathwel
TCGA数据库中，泛癌RNA-seq数据显示，SLC2A1 mRNA在多种肿瘤中出现高表达（
图1 SLC2A1表达分析 A：SLC2A1 mRNA在泛癌中的表达；B：SLC2A1 mRNA在正常组织和HCC组织中的表达；C：SLC2A1 mRNA在正常组织和HCC组织中表达水平的配对分析；D：不同TNM分期患者SLC2A1 mRNA表达水平；E：HCC组织与癌旁组织SLC2A1表达的免疫组化分析（×40）；F：80对HCC组织和癌旁组织SLC2A1免疫组化染色的定量分析
Figure 1 SLC2A1 expression analysis A: Expression of SLC2A1 mRNA in pan-cancer; B: Expression of SLC2A1 mRNA in normal tissues and HCC tissues; C: Paired analysis of SLC2A1 mRNA expression levels in normal and HCC tissues; D: SLC2A1 mRNA expression levels in patients with different TNM stages; E: Immunohistochemical analysis of SLC2A1 expression in HCC tissues and adjacent non-tumor tissues (×40); F: Quantitative analysis of immunohistochemical staining of SLC2A1 in 80 pairs of HCC and adjacent non-tumor tissues
根据免疫组化染色强度将临床样本80例患者平均分为高表达组和低表达组。分析SLC2A1表达水平与HCC临床病理特征之间的关系，结果显示，SLC2A1表达水平与TNM分期（P=0.018）、乙型病毒性肝炎（P=0.004）和血管侵犯（P=0.001）明显有关（
| 因素 | 低表达（n=40） | 高表达（n=40） | P | 因素 | 低表达（n=40） | 高表达（n=40） | P | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 性别 | 肿瘤数量 | |||||||
| 女 | 24（60.0） | 17（42.5） | 0.825 | 单发 | 26（65.0） | 27（67.5） | 0.113 | |
| 男 | 16（40.0） | 23（57.5） | 多发 | 14（35.0） | 13（32.5） | |||
| 年龄（岁） | AFP（ng/mL） | |||||||
| ≤60 | 15（37.5） | 13（32.5） | 0.435 | ≤400 | 10（25.0） | 11（27.5） | 0.847 | |
| >60 | 25（62.5） | 27（67.5） | >400 | 30（75.0） | 29（72.5） | |||
| TNM分期 | 肝功能Child-Pugh分级 | |||||||
| Ⅰ/Ⅱ | 21（52.5） | 17（42.5） | 0.018 | A级 | 18（45.0） | 16（40.0） | 0.360 | |
| Ⅲ/Ⅳ | 19（47.5） | 23（57.5） | B级 | 12（30.0） | 15（37.5） | |||
| 乙型病毒性肝炎 | C级 | 10（25.0） | 9（22.5） | |||||
| 有 | 35（87.5） | 33（82.5） | 0.004 | 肝硬化 | ||||
| 无 | 5（12.5） | 7（17.5） | 有 | 21（52.5） | 17（42.5） | 0.641 | ||
| 肿瘤大小（cm） | 无 | 19（47.5） | 23（57.5） | |||||
| ≤5 | 14（35.0） | 12（30.0） | 0.125 | 血管侵犯 | ||||
| >5 | 26（65.0） | 28（70.0） | 有 | 9（22.5） | 7（17.5） | 0.001 | ||
| 无 | 31（77.5） | 33（82.5） |
首先，通过Kaplan-Meier生存分析研究SLC2A1高表达和低表达患者的总生存期（OS）、疾病特异性生存期（DSS）和无复发间期（PFI）。TCGA数据结果显示，高表达组与低表达组相比具有较差的OS（HR=2.50，95% CI=1.76~3.56，P<0.001）、DSS（HR=2.13，95% CI=1.34~3.37，P=0.001）和PFI（HR=1.42，95% CI=1.05~1.93，P=0.025）（
图2 SLC2A1表达与HCC的预后的关系分析 A：TCGA数据分析；B：临床样本分析
Figure 2 Analysis of the relationship between SLC2A1 expression and HCC prognosis A: TCGA data analysis; B: Clinical sample analysis
图3 SLC2A1表达与HCC各亚组预后的关系
Figure 3 Relationship between SLC2A11 expression and prognosis of HCC subgroups
| 因素 | 单因素分析 | 多因素分析 | ||
|---|---|---|---|---|
| HR（95% CI） | P | HR（95% CI） | P | |
| 年龄 | 0.992（0.973~1.011） | 0.405 | — | — |
| 性别 | 1.700（0.821~3.522） | 0.153 | — | — |
| TNM分期 | 1.921（1.365~1.554） | 0.010 | 1.365（1.221~2.365） | 0.055 |
| 血管侵犯 | 1.925（1.253~2.958） | 0.003 | 1.657（1.036~2.652） | 0.035 |
| 乙型病毒性肝炎 | 1.365（0.624~1.654） | 0.029 | — | — |
| AFP | 1.629（1.063~2.479） | 0.025 | 1.362（0.861~2.157） | 0.187 |
| SLC2A1 | 1.934（1.261~2.965） | 0.002 | 1.753（1.132~2.715） | 0.012 |
为进一步探讨SLC2A1在HCC中的生物学功能，分析SLC2A1高表达和SLC2A1低表达样本中的差异表达基因。以|log FC|>2、校正P<0.05为筛选标准，共鉴定出473个差异表达基因（448个基因表达上调、25个基因表达下调）；并绘制火山图（
图4 差异表达基因分析 A：火山图；B：热图
Figure 4 Differentially expressed gene analysis A: Volcano plot; B: Heatmap
图5 差异表达基因的富集分析 A：GO富集分析；B：KEGG富集分析
Figure 5 Enrichment analysis of differentially expressed genes A: GO enrichment analysis; B: KEGG enrichment analysis
m6A RNA甲基化修饰在HCC的发展中具有重要作用，且富集分析显示大量差异表达基因富集于RNA甲基化。因此，本研究进一步分析TCGA数据库，探讨SLC2A1与20个m6A相关基因在HCC中表达水平之间的相关性。结果显示，SLC2A1表达水平与16个m6A相关基因呈明显正相关，包括METTL3（r=0.225，P<0.01）、WTAP（r=0.355，P<0.01）、VIRMA（r=0.221，P<0.01）、RBM15（r=0.345，P<0.01）、RBM15B（r=0.267，P<0.01）、YTHDC1（r=0.306，P<0.01）、YTHDC2（r=0.159，P<0.01）、YTHDF1（r=0.292，P<0.01）、YTHDF2（r=0.472，P<0.01）、HNRNPC（r=0.316，P<0.01）、IGF2BP1（r=0.143，P<0.01）、IGF2BP2（r=0.204，P<0.01）、IGF2BP3（r=0.343，P < 0.01）、RBMX（r=0.431，P<0.01）、HNRNPA2B1（r=0.338，P<0.01）和FTO（r=0.289，P<0.01）（
图6 SLC2A1表达与m6A RNA甲基化修饰的相关性分析 A：SLC2A1与m6A相关基因的相关性；B-C：m6A相关基因在SLC2A1高低表达组中的差异表达
Figure 6 Correlation analysis between SLC2A1 expression and m6A RNA methylation modification A: Correlation between SLC2A1 and m6A-related genes; B-C: Differential expression of m6A-related genes in high and low SLC2A1 expression groups
免疫细胞浸润是肿瘤微环境的重要组成部
图7 SLC2A1表达与免疫细胞浸润水平的相关性分析
Figure 7 Correlation analysis between SLC2A1 expression and immune cell infiltration levels
糖酵解水平的增加是肿瘤细胞糖酵解代谢的主要特征之
研
迄今为止，关于SLC2A1在恶性肿瘤中的作用机制研究主要集中在糖酵解方面。为进一步研究其在HCC中的生物学功能，首先分析了SLC2A1高低表达组中的差异表达基因。共鉴定出473个差异表达基因，其中448个基因表达上调，25个基因表达下调。随后对与SLC2A1密切相关的基因进行富集分析，发现主要富集于DNA replication、RNA甲基化、P53信号通路，cell cycle信号通路等。m6A RNA甲基化是一种重要的mRNA修饰，在肿瘤增殖和迁移等生物学过程中发挥着非常重要的作
恶性肿瘤中的免疫细胞浸润会影响化疗、放疗、免疫治疗的有效性以及癌症患者的预
综上所述，SLC2A1在HCC中高表达，并且高表达与预后不良相关。SLC2A1有望成为HCC患者不良预后的新型生物标志物。
作者贡献声明
柏斗胜负责论文设计、基金提供；陈勇治负责数据分析、文章撰写等。
利益冲突
所有作者均声明不存在利益冲突。
参考文献
Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin, 2018, 68(6):394-424. doi:10.3322/caac.21492. [百度学术]
Vogel A, Meyer T, Sapisochin G, et al. Hepatocellular carcinoma[J]. Lancet, 2022, 400(10360):1345-1362. doi:10.1016/s0140-6736(22)01200-4. [百度学术]
Singal AG, Kanwal F, Llovet JM. Global trends in hepatocellular carcinoma epidemiology: implications for screening, prevention and therapy[J]. Nat Rev Clin Oncol, 2023, 20(12):864-884. doi:10.1038/s41571-023-00825-3. [百度学术]
Lou WY, Liu JX, Ding BS, et al. Identification of potential miRNA-mRNA regulatory network contributing to pathogenesis of HBV-related HCC[J]. J Transl Med, 2019, 17(1):7. doi:10.1186/s12967-018-1761-7. [百度学术]
Vandenbulcke H, Moreno C, Colle I, et al. Alcohol intake increases the risk of HCC in hepatitis C virus-related compensated cirrhosis: a prospective study[J]. J Hepatol, 2016, 65(3):543-551. doi:10.1016/j.jhep.2016.04.031. [百度学术]
Heimbach JK, Kulik LM, Finn RS, et al. AASLD guidelines for the treatment of hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2018, 67(1):358-380. doi:10.1002/hep.29086. [百度学术]
Shi YL, Wang YZ, Niu KY, et al. How CLSPN could demystify its prognostic value and potential molecular mechanism for hepatocellular carcinoma: a crosstalk study[J]. Comput Biol Med, 2024, 172:108260. doi:10.1016/j.compbiomed.2024.108260. [百度学术]
孙丹, 费浩然, 仲成成, 等. 跨膜蛋白201在肝细胞癌中的表达及其预后意义与作用机制[J]. 中国普通外科杂志, 2024, 33(1):61-73. doi:10.7659/j.issn.1005-6947.2024.01.008. [百度学术]
Sun D, Fei HR, Zhong CC, et al. Expression and of transmembrane protein 201 in hepatocellular carcinoma and its prognostic significance and action mechanism[J]. China Journal of General Surgery, 2024, 33(1):61-73. doi:10.7659/j.issn.1005-6947.2024.01.008. [百度学术]
Wang Q, Chen C, Ding QQ, et al. METTL3-mediated m6A modification of HDGF mRNA promotes gastric cancer progression and has prognostic significance[J]. Gut, 2020, 69(7):1193-1205. doi:10.1136/gutjnl-2019-319639. [百度学术]
Wu X, Shen J, Jiang XY, et al. Targeting GLUT1 degradation with assembling glycopeptide for cancer inhibition[J]. Chem Eng J, 2024, 493:152479. doi:10.1016/j.cej.2024.152479. [百度学术]
Shen CQ, Xuan BQ, Yan TT, et al. m6A-dependent glycolysis enhances colorectal cancer progression[J]. Mol Cancer, 2020, 19(1):72. doi:10.1186/s12943-020-01190-w. [百度学术]
Pereira KM, Chaves FN, Viana TS, et al. Oxygen metabolism in oral cancer: HIF and GLUTs (Review)[J]. Oncol Lett, 2013, 6(2): 311-316. doi:10.3892/ol.2013.1371. [百度学术]
Rudlowski C, Moser M, Becker AJ, et al. GLUT1 mRNA and protein expression in ovarian borderline tumors and cancer[J]. Oncology, 2004, 66(5):404-410. doi:10.1159/000079489. [百度学术]
van Laarhoven HWM, Kaanders JHAM, Lok J, et al. Hypoxia in relation to vasculature and proliferation in liver metastases in patients with colorectal cancer[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2006, 64(2):473-482. doi:10.1016/j.ijrobp.2005.07.982. [百度学术]
Pliszka M, Szablewski L. Glucose transporters as a target for anticancer therapy[J]. Cancers, 2021, 13(16):4184. doi:10.3390/cancers13164184. [百度学术]
Avanzato D, Pupo E, Ducano N, et al. High USP6NL levels in breast cancer sustain chronic AKT phosphorylation and GLUT1 stability fueling aerobic glycolysis[J]. Cancer Res, 2018, 78(13):3432-3444. doi:10.1158/0008-5472.CAN-17-3018. [百度学术]
Peng Q, Hao LY, Guo YL, et al. Solute carrier family 2 members 1 and 2 as prognostic biomarkers in hepatocellular carcinoma associated with immune infiltration[J]. World J Clin Cases, 2022, 10(13):3989-4019. doi:10.12998/wjcc.v10.i13.3989. [百度学术]
Jamieson A, McAlpine JN. Molecular profiling of endometrial cancer from TCGA to clinical practice[J]. J Natl Compr Canc Netw, 2023, 21(2):210-216. doi:10.6004/jnccn.2022.7096. [百度学术]
Li B, Severson E, Pignon JC, et al. Comprehensive analyses of tumor immunity: implications for cancer immunotherapy[J]. Genome Biol, 2016, 17(1):174. doi:10.1186/s13059-016-1028-7. [百度学术]
Li TW, Fan JY, Wang BB, et al. TIMER: a web server for comprehensive analysis of tumor-infiltrating immune cells[J]. Cancer Res, 2017, 77(21):e108-e110. doi:10.1158/0008-5472.CAN-17-0307. [百度学术]
Zhang W, Shen YM, Huang HH, et al. A Rosetta stone for breast cancer: prognostic value and dynamic regulation of neutrophil in tumor microenvironment[J]. Front Immunol, 2020, 11:1779. doi:10.3389/fimmu.2020.01779. [百度学术]
Li ZY, Zhang HF. Reprogramming of glucose, fatty acid and amino acid metabolism for cancer progression[J]. Cell Mol Life Sci, 2016, 73(2):377-392. doi:10.1007/s00018-015-2070-4. [百度学术]
Ooi AT, Gomperts BN. Molecular pathways: targeting cellular energy metabolism in cancer via inhibition of SLC2A1 and LDHA[J]. Clin Cancer Res, 2015, 21(11):2440-2444. doi:10.1158/1078-0432.CCR-14-1209. [百度学术]
Wu LJ, Jin YT, Zhao X, et al. Tumor aerobic glycolysis confers immune evasion through modulating sensitivity to Tcell-mediated bystander killing via TNF-Α[J]. Cell Metab, 2023, 35(9):1580-1596. doi:10.1016/j.cmet.2023.07.001. [百度学术]
Berlth F, Mönig S, Pinther B, et al. Both GLUT-1 and GLUT-14 are independent prognostic factors in gastric adenocarcinoma[J]. Ann Surg Oncol, 2015, 22(Suppl 3):S822-S831. doi:10.1245/s10434-015-4730-x. [百度学术]
Osugi J, Yamaura T, Muto S, et al. Prognostic impact of the combination of glucose transporter 1 and ATP citrate lyase in node-negative patients with non-small lung cancer[J]. Lung Cancer, 2015, 88(3):310-318. doi:10.1016/j.lungcan.2015.03.004. [百度学术]
LaRue MM, Parker S, Puccini J, et al. Metabolic reprogramming of tumor-associated macrophages by collagen turnover promotes fibrosis in pancreatic cancer[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2022, 119(16):e2119168119. doi:10.1073/pnas.2119168119. [百度学术]
Liu XS, Gao Y, Wu LB, et al. Comprehensive analysis of GLUT1 immune infiltrates and ceRNA network in human esophageal carcinoma[J]. Front Oncol, 2021, 11:665388. doi:10.3389/fonc.2021.665388. [百度学术]
Chen DH, Zhang JG, Wu CX, et al. Non-coding RNA m6A modification in cancer: mechanisms and therapeutic targets[J]. Front Cell Dev Biol, 2021, 9:778582. doi:10.3389/fcell.2021.778582. [百度学术]
Zheng HS, Long GJ, Zheng YZ, et al. Glycolysis-related SLC2A1 is a potential pan-cancer biomarker for prognosis and immunotherapy[J]. Cancers, 2022, 14(21):5344. doi:10.3390/cancers14215344. [百度学术]
Waniczek D, Lorenc Z, Śnietura M, et al. Tumor-associated macrophages and regulatory T cells infiltration and the clinical outcome in colorectal cancer[J]. Arch Immunol Ther Exp, 2017, 65(5):445-454. doi:10.1007/s00005-017-0463-9. [百度学术]
Zhang H, Liu H, Shen ZB, et al. Tumor-infiltrating neutrophils is prognostic and predictive for postoperative adjuvant chemotherapy benefit in patients with gastric cancer[J]. Ann Surg, 2018, 267(2):311-318. doi:10.1097/SLA.0000000000002058. [百度学术]
Lyu LJ, Yao J, Wang M, et al. Overexpressed pseudogene HLA-DPB2 promotes tumor immune infiltrates by regulating HLA-DPB1 and indicates a better prognosis in breast cancer[J]. Front Oncol, 2020, 10:1245. doi:10.3389/fonc.2020.01245. [百度学术]
Ancey PB, Contat C, Boivin G, et al. GLUT1 expression in tumor-associated neutrophils promotes lung cancer growth and resistance to radiotherapy[J]. Cancer Res, 2021, 81(9):2345-2357. doi:10.1158/0008-5472.CAN-20-2870. [百度学术]
Biffi G, Tuveson DA. Diversity and biology of cancer-associated fibroblasts[J]. Physiol Rev, 2021, 101(1):147-176. doi:10.1152/physrev.00048.2019. [百度学术]
Kaltenmeier C, Yazdani HO, Morder K, et al. Neutrophil extracellular traps promote T cell exhaustion in the tumor microenvironment[J]. Front Immunol, 2021, 12:785222. doi:10.3389/fimmu.2021.785222. [百度学术]
Sun KX, Tang SF, Hou YX, et al. Oxidized ATM-mediated glycolysis enhancement in breast cancer-associated fibroblasts contributes to tumor invasion through lactate as metabolic coupling[J]. EBioMedicine, 2019, 41:370-383. doi:10.1016/j.ebiom.2019.02.025. [百度学术]